高纤溶活性黄芪豆豉发酵条件的优化

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　　摘要 [目的]确定黄芪与大豆共发酵制备一种具有高纤溶活性黄芪豆豉的最优发酵工艺。[方法]以黄芪水提液浸泡大豆作为发酵基质，以淡豆豉来源的4株枯草芽孢杆菌作为发酵菌株，以纤溶酶活性为考察指标，通过对發酵菌株的筛选、黄芪提取液的浓度和比例以及发酵时间的考察，筛选最优发酵工艺。[结果]黄芪豆豉的最优发酵工艺：黄芪水提液浓度为75 mg/mL，黄芪水提液与大豆的比例为1∶1（mL∶g），最优发酵菌株为DCT-1，于37 ℃发酵36 h。[结论]黄芪与大豆共发酵制备黄芪豆豉，既提高了豆豉的纤溶酶活性，又兼具黄芪的补气功效，提供了一种具有益气活血作用的食疗产品。
　　关键词 黄芪;豆豉;发酵工艺;纤溶酶活性;益气活血
　　中图分类号 TS264  文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2020）18-0162-03
　　Abstract [Objective]Astragalus membranaceus and soybean were cofermented to prepare fermented soya beans with high fibrinolytic activity， and confirming the optimal fermentation process.[Method]Soybean was soaked in astragalus aqueous extract as the fermentation substrate， and 4 strains of Bacillus subtilis separated from Sojae Semen Praepartum were used as the fermentation strains， with fibrinolytic activity as the index， and the optimal fermentation technology was selected through the screening of strains， the concentration and proportion of astragalus extract and the fermentation time.[Result]The results showed that the optimal fermentation process of Astragalus membranaceusfermented soya beans was as follows： astragalus water extract concentration was 75 mg/mL， the proportion of astragalus water extract and soybean was 1∶1（mL∶g）， DCT1 was the optimal fermentation strain， and fermented at 37 ℃ for 36 h.[Conculsion]The cofermentation of astragalus and soybean not only improved the fibrinolytic activity of fermented soya beans， but also had the effect of supplementing breath of astragalus， providing a kind of food therapy product with the function of Yiqi Huoxue.
　　Key words Astragalus membranaceus;Fermented soya beans;Fermentation process;Fibrinolytic activity;Yiqi Huoxue
　　豆豉为我国传统大豆发酵调味品，具有一定的药用价值[1]。我国不同地域已形成了很多独具特色的豆豉产品，其中潼川豆豉和永川豆豉已被列入国家级非物质文化遗产[2]。传统豆豉是在自然环境条件下由多菌种混合发酵而成，其风味和生理活性物质的含量受加入的辅料、生产环境、生产工艺等因素的影响，如中药淡豆豉是大豆与青蒿、桑叶或紫苏、麻黄发酵后制成因而具有不同的药性[3-4]。豆豉在自然发酵过程中存在污染有害菌的风险[5-6]，采用纯种发酵可有效避免此现象发生。豆豉含有多种营养和生理活性成分，其中豆豉纤溶酶可有效溶解血栓，长期食用可预防心脑血管疾病的发生，且无毒副作用[7]，而枯草芽孢杆菌为产豆豉纤溶酶的主要发酵菌[8]。心脑血管疾病患者常伴有气虚血瘀症状，在改善血液循环的同时应加强补气[9]。黄芪为常用的补气中药，黄芪多糖可促进益生菌芽孢杆菌的增长，芽孢杆菌发酵黄芪可提高活性成分的含量，增强药效[10-12]。
　　笔者以大豆辅以黄芪作为发酵基质，采用枯草芽孢杆菌纯菌种发酵制备一种具有益气活血作用的黄芪豆豉，通过对发酵菌株、黄芪提取液的浓度及比例、发酵时间等因素的考察，以纤溶酶活性为指标，筛选最优发酵工艺，为黄芪豆豉作为食疗产品的应用提供依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 原材料。 黄芪饮片由亳州市张仲景中药饮片有限责任公司生产，经黑龙江省中医药科学院王伟明研究员鉴定为豆科植物蒙古黄芪[Astragalus membrannceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao]的干燥根;黄豆由黑龙江省农业科学院提供，2017年种植采收。
　　1.1.2 试剂。尿激酶（140604-201224）、牛血清纤维蛋白原（140607-201841）、凝血酶原（140605-201526）均购自中国食品药品检定研究院，琼脂糖购自BIOWEST公司。营养琼脂培养基、营养肉汤培养基均购自青岛海博生物技术有限公司，其他试剂均为分析纯。 　　1.1.3 发酵菌株。DCT-1、DCT-2、DCT-3、DCT-4均分离自淡豆豉饮片。
　　1.1.4 仪器。Biolog自动微生物鉴定系统，MF3菌落分析仪，DHP 9272恒温培養箱，BSC-1360生物安全柜，BSA224S 赛多利斯电子天平，UV-2500 紫外可见分光光度计。
　　1.2 方法
　　1.2.1 分离菌株的鉴定。采用Biolog 自动微生物鉴定系统对淡豆豉来源的4株菌进行鉴定[13]。用棉签挑取单个菌落至IF接种液中，调节浊度为（95±3）%的菌悬液，在Biolog Gen Ⅲ微孔板上每孔加100 μL菌悬液，于33 ℃孵育24 h读取结果，获得4株菌的代谢指纹图谱，根据每株菌的碳源利用阳性孔（显紫色）的OD值，计算每株菌的平均碳源利用率（average well color development，AWCD），计算公式如下：
　　AWCD=ni=1（Ci-R）/n
　　式中，Ci为各碳源孔在590 nm下的吸光度值与750 nm下吸光度值的差值;R为对照孔A1的吸光度值，n为利用的碳源数[14];分析每株菌对单一碳源的利用情况，以各碳源孔在590 nm下的吸光度值与750 nm下吸光度值的差值减去对照孔A1的吸光度值（Ci-R）表示。
　　1.2.2 优势发酵菌株的筛选。采用比浊法[15]考察4株菌在以蒸馏水配制的营养肉汤（NB）和黄芪提取液配制的营养肉汤（HNB）的生长情况。称取30 g黄芪，加300 mL的水，煎煮2次，每次1 h，合并滤液，浓缩至含黄芪生药量75 mg/mL的溶液。将DCT-1、DCT-2、DCT-3、DCT-4分别接种于NB和HNB中，于37 ℃、180 r/min摇床培养36 h，每隔6 h取样，采用紫外分光光度法于波长600 nm处测定菌液吸光度（OD）值，以不接菌的NB和HNB为空白对照（0 h），参照范晓丹等[16]的方法稍作改动测定纤溶酶活性。试剂的配制：a液，0.01 mol/L 的NaH2PO4溶液;b液，0.01 mol/L的Na2HPO4溶液;c液，将a液与b液按照19.05∶100（mL∶mL）比例混合。工作液：0.9% NaCl溶液与c液按照1∶17（mL∶mL）混合。用工作液分别配制1%琼脂糖溶液和0.3%纤维蛋白原溶液，55 ℃ 温育，加入凝血酶原（1 BP/mL）混匀、铺板，凝固待用。将4株菌在NB和HNB生长24 h的溶液作为供试液，分别取供试液和20、40、60、80、100 U/mL尿激酶标准溶液各10 μL，置于打孔的琼脂糖纤维蛋白平板中，37 ℃孵育18 h，用MF3菌落分析仪测定纤溶圈面积（mm2）。以纤溶圈面积为纵坐标（Y）、尿激酶标准溶液浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，根据线性回归方程计算样品的纤溶酶活性。
　　1.2.3 黄芪提取液最佳浓度的考察。称取黄芪加10倍量的水，煎煮2次，每次1 h，合并滤液，制成浓度分别为50、75、150、200、250、300 mg/mL的黄芪提取液。分别用不同浓度的黄芪提取液代替蒸馏水配制营养肉汤，以蒸馏水配制的营养肉汤作对照，接种DCT-1菌，180 r/min、37 ℃摇床培养36 h，每6 h于波长600 nm处测定菌液OD值。
　　1.2.4 黄芪豆豉的发酵时间考察。以75 mg/mL的黄芪提取液按照1∶1（mL∶g）浸泡大豆，待大豆吸尽溶液，装袋，于121 ℃灭菌40 min，接种DCT-1菌液（108 CFU/mL，2%），37 ℃恒温培养96 h，制备黄芪豆豉，然后分别于12、24、36、48、72、96 h取样，测定不同发酵阶段样品的纤溶酶活性。
　　2 结果与分析
　　2.1 Biolog鉴定结果及碳源利用情况 由表1可知，DCT-1、DCT-2、DCT-3均为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），DCT-4为枯草芽孢杆菌亚种（Bacillus subtilis B），但菌落形态存在明显差异。
　　 4株菌的碳源利用情况见图1。4株菌利用碳源的种类比较集中，但不同菌株之间也存在差异。71种碳源中，仅利用D-山梨醇（D1）、甘油（D5）、L-丙氨酸（E3）、L-乳酸（G4）、柠檬酸（G5）、L-苹果酸（G8）6种碳源，其中4株菌均利用L-丙氨酸、L-苹果酸和L-乳酸，DCT-1和DCT-2对6种碳源均有不同程度的利用，除DCT-4外，其他3株菌对D-山梨醇的利用能力均较强，以DCT-1的OD值最大，DCT-2不利用柠檬酸。从4株菌利用的碳源阳性孔分析，DCT-1的AWCD值最高，为0.326 0;而DCT-2、DCT-3和DCT-4的AWCD值分别为0.284 5、0.227 7和0.214 7。可见，DCT-1对碳源代谢率最高。Biolog自动微生物鉴定系统是基于碳源代谢基础上的微生物鉴定方法，结果快速、准确。Gen III 板可分析好氧细菌对71种碳源（1-9列中除A1为阴性对照孔外的71种碳源，10-12列为化学敏感性测试）的利用情况，建立碳源利用表型指纹图谱[14]。从4株菌利用的6种碳源情况来看，L-乳酸、柠檬酸、L-苹果酸为有机酸，既可作为碳源，又能维持微生物生长所需的酸碱度环境;L-丙氨酸可提供微生物生长的氮源，甘油和D-山梨醇既能提供微生物生长的碳源，又有利于微生物来源抗菌肽的合成[17]。白杰等[18]研究表明，枯草芽孢杆菌能够产生抗菌肽，与其利用D-山梨醇和甘油2种碳源密切相关。该研究中，DCT-1菌对D-山梨醇和甘油的利用率最高，表明其产抗菌肽的能力最强。
　　2.2 发酵菌株的筛选 4株菌在含黄芪和不含黄芪的液体培养基生长情况见图2。由图2可知，6 h后各菌液浊度均迅速上升，含有黄芪菌液的浊度明显高于不含黄芪的菌液，且随着培养时间的延长呈剂量依赖性。在不含黄芪的营养肉汤中，DCT-1和DCT-2的生长速度高于DCT-3和DCT-4;在含黄芪的培养液中，DCT-1生长最快，DCT-4生长最慢，DCT-2和DCT-3生长速度接近。 　　黄芪对4株菌纤溶酶活性的影响结果见表2。由表2可见，除DCT-4在NB和HNB培养液中生长未检测到明显纤溶酶活性外，黄芪均能提高其他3株菌的纤溶酶活性，以DCT-1菌酶活最高，在NB和HNB上生长的菌液纤溶酶活分別为（50.89±2.15）和（115.78±7.64）IU/mL。表明黄芪能够促进枯草芽孢杆菌的生长，并提高纤溶酶活性，这与乔宏兴等[19]研究结果一致，但DCT-4为Bacillus subtilis B，是枯草芽孢杆菌亚种，其平均碳源利用率最低（表1），纤溶酶活性也最低，不能作为提高豆豉纤溶酶活性的发酵菌，另外3株菌加入黄芪均能提高菌液的纤溶酶活，且以DCT-1最佳。
　　2.3 黄芪提取液的最佳浓度 由图3可知，不同浓度黄芪提取液均能促进DCT-1菌的生长，且随着发酵时间的延长，菌液的浊度逐渐升高。发酵前12 h 高浓度黄芪培养液的OD值更高，可能是由于高浓度黄芪使溶液颜色更深，12 h后随着细菌快速繁殖，各培养液浊度增长与黄芪浓度不一致，其中DCT-1菌在黄芪浓度为50、75和150 mg/mL培养液中的生长速度高于在200、250、300 mg/mL培养液中的生长速度。当黄芪浓度为75 mg/mL时，DCT-1菌生长最快，表明此浓度更利于该菌的生长，而在高浓度的黄芪提取液中反而生长缓慢，可能是由于高浓度黄芪有抑菌作用而呈现低浓度促进、高浓度抑制生长的现象。文宇婷等[20]研究表明，黄芪水提液中含有多糖，低浓度的黄芪多糖可促进芽孢杆菌的生长，而高浓度则表现为抑制，与该试验结果基本一致。
　　2.4 黄芪豆豉的最佳发酵时间 由图4可知，随着发酵时间的延长，黄芪豆豉的纤溶酶活性呈先升高后降低的趋势，发酵初期纤溶酶活性快速增长，36 h达到峰值831.94 IU/g，然后缓慢下降，96 h纤溶酶活性仍保持在600 IU/g以上，表明最佳发酵时间为36 h。
　　
　　3 结论与讨论
　　枯草芽孢杆菌的最适培养温度为（37±2） ℃，通过前期试验摸索确定了黄芪提取液与大豆的配比为1∶1 （mL∶g）可被大豆完全吸尽，因此未对发酵温度及黄芪提取液与大豆的配比进行考察。综上研究结果，最终确定黄芪豆豉的最佳发酵条件为黄芪提取液浓度75 mg/mL，黄芪提取液与大豆的比例1∶1 （mL∶g），发酵菌为DCT-1，37 ℃发酵36 h。在此工艺条件下，黄芪豆豉的纤溶酶活性最高，但其药理药效结果尚待进一步研究。
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