?辣椒疫霉病拮抗菌LRS-1固体发酵条件优化及其抑菌稳定性研究

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　　摘 要：为了生防型多粘类芽孢杆菌LRS-1的大规模生产应用，以LRS-1固体发酵活菌数为指标，研究了麦麸和草炭基本基质配比、碳源、氮源、初始含水量以及发酵时间、接种量、种龄等条件对LRS-1菌株固体发酵效果的影响;同时，以平板抑菌率为指标，研究了温度和pH值对LRS-1抑菌稳定性的影响。结果表明：LRS-1的最优固体发酵条件为麦麸与草炭的比例为30∶20，大米添加量12%，小米添加量25%，初始含水量80%，发酵时间6 d， 接种量30%，种龄72 h;LRS-1在30℃左右与中碱性环境中可以保持稳定的抑菌效果。
　　关键词：生防型多粘类芽孢杆菌LRS-1;固体发酵;抑菌稳定性
　　中图分类号：Q939.92 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2020）04-0001-05
　　 Optimization of Solid Fermentation Conditions for LRS-1 against Phytophthora capsicum Disease and Its Antibacterial Stability
　　 ZHANG Liang1，ZHANG Zhou1，TAN Li2，SHENG Hao1，YUAN Hong1，DENG Li-ping3
　　（1. College of Resources and Environment， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC;
　　2. Soil Fertilizer Station， Liling Agricultural Bureau， Liling 412200， PRC;
　　3. Agricultural Technology Promotion Center， Liling 412200， PRC）
　　Abstract： In order to explore the optimal solid fermentation conditions of Paenibacillus polymyxa LRS-1 and its bacterial inhibition stability， and provide the necessary technical support for the LRS-1's mass production， the effects of the ratio of wheat bran and peat， carbon source， nitrogen source， initial water content ， fermentation time， inoculum size and inoculum age on the solid fermentation effect of LRS-1 with the number of viable bacteria as index， as well as the effect of temperature and pH value on its antibacterial stability with antibacterial rate as index was studied in this paper. The final results showed that the optimal solid fermentation conditions of LRS-1 were：the ratio of wheat bran and peat 30∶20， 12% rice and 25% millet， initial water content 80%， fermentation time 6 d，  inoculum size 30%， inoculum age 72 h. Antibacterial stability showed that at around 30℃ in medium alkaline environment， LRS-1 could maintain the stable antibacterial effect .
　　Key words： Paenibacillus polymyxa LRS-1; solid fermentation; antibacterial stability
　　辣椒疫霉病（Phytophthora capsicum Disease）是由卵菌侵染辣椒引起的土传病害，其病原菌除危害辣椒外，还可侵染黄瓜、茄子、西瓜、南瓜等作物，对其产量和品质构成严重威胁[1-2]。该病原菌的卵孢子在土壤中存活时间长，能够侵染的宿主范围广，防治难度较大。以往人们大多采用喷洒化学农药的方法对辣椒疫霉病害进行防控，但此类手段易对环境与人体健康构成威胁[3-6]。随着绿色农业的兴起，生物防控以其环保、高效等优点成为当下土壤病害防治的热点和必然选择[7-9]。
　　固体发酵是指在没有或几乎没有自由水存在的条件下，以有一定湿度的水不溶性固态基质培养微生物的过程。从生物反应过程的本质考虑，固体发酵是以气相为连续相的生物反应过程，具有操作简便、能耗低、发酵过程易控、对无菌要求相对较低、不易发生大面积污染等优点。现今生产中应用的生防活菌剂普遍存在不易保存、活性不穩定等问题，而通过固体发酵生产的菌剂孢子数量多、活性强、便于保藏和运输， 并且固体发酵设备简单、成本低廉、易于在生产中应用推广[10-12]。生防型多粘类芽孢杆菌LRS-1是课题组于水稻土壤中筛选获得的生防菌株，前期试验已证实了其对辣椒疫霉病害具有显著的防治效果，开发利用潜力大[13]。如果将LRS-1菌株进行发酵并制成生物肥料，将对辣椒疫霉病等的土传病害防治工作起到有力的促进作用。该研究从固体发酵基质、碳氮源、水分控制、发酵时间、接种量等方面进行分析与研究，以探明LRS-1固体发酵的最适条件，同时也研究了LRS-1的热力抑菌稳定性和酸碱抑菌稳定性，以探明LRS-1稳定抑菌的最适温度和pH值。 　　1 材料与方法
　　1.1 供试材料
　　1.1.1 供试菌种 生防型多粘类芽孢杆菌LRS-1：由湖南农业大学资源环境学院土壤微生物实验室从水稻土壤中分离、鉴定和保存，并经500 μg/mL利福平标记。病原菌：辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）It 263，保存于湖南省植物保护研究所。
　　1.1.2 发酵培养基 种子培养基：细菌培养采取NBY培养基（营养肉汤粉8 g/L，酵母提取物2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L， 磷酸二氢钾0.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L，七水合硫酸镁 1 mol/mL，去离子水配制，琼脂18 g/L）;真菌培养采用PDA培养基（马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，去离子水配制，琼脂18 g/L）。液体培养时均不添加琼脂。固体发酵培养基：以麦麸和草炭为基本基质，添加适宜的碳源、氮源和初始含水量进行发酵。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 生防菌LRS-1种子液的制备 将28℃培养7 d的生防菌LRS-1菌种制成1×106 CFU/mL的菌悬液。取2 mL菌悬液接种于100 mL NBY液体培养基中，于28℃、170 r/min振荡培养96 h，培养物即为种子液。
　　1.2.2 生防菌LRS-1固体发酵培养基的优化 （1）基本基质配比的优化。麦麸与草炭比例共设置11个处理，分别为50∶0、45∶5、40∶10、35∶15、30∶20、25∶25、20∶30、15∶35、10∶40、5∶45、0∶50。120℃湿热灭菌30 min，接入LRS-1种子液，每组重复3次，接种量为5%，28 ℃培养7 d，观察其生长状况，然后在含有500 μg/mL利福平的NBY琼脂培养基上用稀释平板计数法测定活菌数。（2）碳源与氮源的优化。碳源为玉米淀粉和大米粉，氮源为小米粉和黄豆粉，各设置5个处理。碳源添加量分别为4%、8%、12%、16%、20%;氮源添加量分别10%、15%、20%、25%、30%;对照组不添加碳源和氮源。120℃湿热灭菌30 min，接入LRS-1种子液，每组重复3次。麦麸与草炭比例为最佳配比，接种量为5%，28 ℃培养7 d，观察其生长状况，然后在含有500 μg/mL利福平的NBY琼脂培养基上用稀释平板计数法测定活菌数。（3）初始含水量的优化。初始含水量共设置6个处理，分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%;对照组初始含水量为0。120 ℃湿热灭菌30 min，接入LRS-1种子液，每组重复3次。麦麸与草炭比例为最佳配比，接种量为5%，28℃培养7 d，观察其生长状况，然后在含有500 μg/mL利福平的NBY琼脂培养基上用稀释平板计数法测定活菌数。
　　1.2.3 生防菌LRS-1固体发酵条件的优化 （1）发酵时间的确定。将摇床培养3 d的种子液以20%（每100 g固体培养基接种20 mL种子液）的接种量接种于优化后的固体培养基中，并分装于器皿中，设3次重复，28 ℃静置培养，分别于第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天各取样1次，自然风干，粉碎成菌粉，测定含菌量。（2）接种量的确定。取培养3 d的种子液，以5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%的接种量接种于优化后的固体培养基中，28 ℃培养9 d后测定固态发酵物的含菌量。（3）种子液种龄的确定。分别取摇床培养24、36、48、60、72、84、96、108 h的种子液，以20%的接种量接种于优化后的固体培养基中，28 ℃培养9 d后测定固态发酵物的含菌量。
　　1.2.4 生防菌LRS-1抑菌稳定性的测定 （1）抑菌热力稳定性的测定。取10份LRS-1菌株液体发酵液，每份5 mL，装入无菌封口试管中，分别在30、40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴锅中加热30 min，对照组不加热，采用平板对峙法（PDA培养基）与病原菌同时接种，培养7 d后观察抑菌效果，每个处理重复3次。（2）抑菌酸碱稳定性的测定。取10份LRS-1菌株液体发酵液，每份5 mL，装入无菌封口试管中，分别用0.5 mol/L NaCO3和10%磷酸調节pH值至3、4、5、6、7、8、9、10，静置1 h后调回初始pH值，采用平板对峙法（PDA培养基）与病原菌同时接种，培养7 d后观察抑菌效果，对照组不调节pH值，每个处理重复3次。
　　1.3 测定方法
　　1.3.1 生防菌LRS-1数量的测定 采用平板计数法进行LRS-1菌落数量的测定[14]，试验中每1 L琼脂培养基加入10 mL 500 μg /mL的利福平抗生素。
　　1.3.2 生防菌LRS-1抑菌性测定 采用平板对峙法进行抑菌效果测定[14]。
　　1.4 数据处理
　　采用DPS8.01软件进行数据分析，采用Excel 2010制图。
　　2 结果与分析
　　2.1 生防菌LRS-1固体发酵培养基的优化
　　2.1.1 最佳基本基质配比 由图1可以看出，固体发酵基本基质配比（即麦麸与草炭的添加比例）对生防菌LRS-1的数量有一定的影响，不同配比的固体发酵基质，生防菌LRS-1的数量也不同。当麦麸与草炭的比例为30∶20时，生防菌LRS-1数量的lg值最大，为8.90。因此，麦麸与草炭的最佳配比为30∶20。
　　2.1.2 最佳碳源与氮源 如图2所示，与对照相比，添加不同种类的碳源均可以促进生防菌LRS-1的生长，说明单纯依靠麦麸与草炭的发酵基质不足以满足生防菌生长的营养需求，需要额外添加碳源。从图2中还可以看出，当添加12%的大米时，生防菌LRS-1数量的lg值达到最大，为8.82。因此，宜选用大米作为培养基碳源，其添加量为12%。
　　如图3所示，不同种类的氮源对生防菌LRS-1的发酵影响不同。与对照相比，以小米为氮源的处理组发酵菌数均有明显增加，而以黄豆为氮源的处理组发酵效果随添加量的增加由促进逐渐转为抑制。 　　从图3中还可以看出，当添加25%的小米时，生防菌LRS-1数量的lg值达到最大，为8.85。因此，宜选用小米作为培养基氮源，其添加量为25%。
　　2.1.3 最佳初始含水量 在保证初始含水量不改变固体发酵基质形态（即只存在极少量自由水）的前提下，试验设计了30%～80%的初始含水量处理。从图4可以看出，与对照相比，当初始含水量低于50%时，活菌数较低，发酵受到抑制;随着初始含水量的继续增加，生防菌LRS-1的数量又明显地增加，说明此时水分对生防菌的发酵起主导作用，结果显示该试验条件下80%的初始含水量最适合生防菌LRS-1的固体发酵。
　　2.2 生防菌LRS-1固体发酵条件的优化
　　2.2.1 发酵时间的确定 由图5可以看出，发酵时间对生防菌LRS-1发酵的影响与微生物繁殖规律相符合，即前期呈现出明显的对数关系，而后趋于平缓。发酵6 d时，生防菌LRS-1数量的lg值达到最大，为8.70。再继续发酵，其数量基本保持稳定。因此，生防菌LRS-1的最佳发酵时间应为6 d。
　　2.2.2 接种量的确定 如图6所示，30%的接种量最适合于生防菌LRS-1的固体发酵，接种量过低或过高均不利于固体培养。接种量低于30%时，生防菌LRS-1在固体基质上生长缓慢，不能深入基质内部，容易被杂菌污染;而接种量高于30%时，水分过多，严重阻碍了菌株的生长。
　　2.2.3 种子液种龄的确定 如图7所示，培养72 h的生防菌LRS-1种子液接种效果最好，发酵物含菌量最大，其l g值达到8.73，说明此阶段的菌体生命力旺盛，能迅速适应基质的固态环境。
　　2.3 生防菌LRS-1抑菌稳定性分析
　　2.3.1 抑菌热力稳定性分析 温度对菌体的生长和代谢产物生成的影响是非常重要的。一方面影响酶促反应的速度，另一方面影响发酵液的物理性质如粘度、基质和溶氧情况。因此合理選择和控制发酵温度对生物活性物质的产生具有重要意义。发酵温度的确定，理论上应根据发酵过程的不同生理阶段而定，但操作难度大。如图8所示，生防菌LRS-1的抑菌率随着温度的升高而降低，30℃时抑菌效果最佳。
　　2.3.2 抑菌酸碱稳定性分析 生防菌的抑菌效果通常受pH值影响较大。如图9 所示，当pH值<6时，生防菌LRS-1的抑菌效果不甚理想，而在中碱性环境中，即当pH值>6时，抑菌率>70%，且抑菌效果趋于平稳，说明中性及碱性环境能让生防菌LRS-1的抑制效果保持稳定。
　　3 结论与讨论
　　固体发酵是微生物常用的培养工艺，具有操作简便，产孢量大，培养物便于存储、运输和田间应用等特点，而适宜的固态培养条件是保证菌株高效发酵的先决条件。接种量是与培养基利用率直接相关的参数，接种量大尽管可以使菌株生长快、周期短，但后期可能因缺乏营养而无法实现高的产菌数;而接种量太少不仅对营养利用不充分，而且发酵周期长，染菌率高。最佳的种液品质（种龄）是保证接种的前提。发酵时间、发酵载体的碳氮类型及比例、发酵初始含水量均会影响生防菌株的发酵效果，这些指标是研判固体发酵条件的必需参数。该研究以合适比例的麦麸和草炭作为固体发酵的基本基质，并分别添加适量的大米和小米作为碳源和氮源，筛选了适宜的初始含水量，得到了优化的固态培养基，即：麦麸与草炭的比例为30∶20，大米和小米的添加量分别为12%和25%，初始含水量为80%。该研究还探明了生防型多粘类芽孢杆菌LRS-1的最佳基本发酵工艺，即接种量为30%、种龄为72 h、发酵时间为6 d。若要大规模生产，后期还需进行大型的料箱发酵试验。
　　生防菌株是具有特殊功效的微生物，保障其抑菌遗传稳定性具有重要意义[15-19]。LRS-1的热力稳定性和酸碱稳定性试验结果表明LRS-1在30℃左右和中碱性环境中可以保持稳定的抑菌效果。
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　　（責任编辑：唐珊珊）
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