IFN-γ在小鼠真菌性角膜炎中的表达
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作者: 陈世坤 胡建章 韩晓丽 徐国兴
[摘要] 目的：通过检测IFN-γ及其转录因子T-bet在小鼠真菌性角膜炎中的表达水平，探讨机体免疫在该病发展中的作用。 方法：应用角膜表层镜法建立小鼠真菌性角膜炎模型，在感染后第1、3、5、7天，观察角膜炎特点与病理变化；半定量RT-PCR和ELISA检测角膜中IFN-γ的表达，半定量RT-PCR检测T-bet的表达。结果：角膜接种菌液后，角膜浸润混浊进行性加重；HE染色可见早期在角膜及前房中有大量的炎性细胞浸润；RT-PCR与ELISA检测结果表明，IFN-γ在角膜接种菌液后均出现表达，在第3天达最高值，而后逐渐降低；T-bet 在第3天达最高值；T-bet mRNA的表达与IFN-γ呈正相关(P<0.05)。结论：在真菌性角膜炎中，Th1型免疫应答在调节机体的抗真菌免疫中发挥重要作用。
[关键词] 真菌性角膜炎 IFN-γ 免疫应答
已知致病性真菌侵入机体后，首先启动非特异性免疫反应，TH1细胞分泌IL-12、IFN-γ等TH1型细胞因子，激活或提高吞噬细胞的抗真菌能力[1]。本研究通过建立Balb/c小鼠的真菌性角膜炎模型，观察其临床特征、病理特点的变化，检测Th1细胞因子（IFN-γ）及其转录因子T-bet的表达，以探讨Th1细胞应答在真菌性角膜炎发生发展中的作用。
1 材料和方法
1.1 动物模型的建立
选用近交系Balb/c小鼠，6~8周龄；菌种选用标准茄病镰刀菌，调整孢子接种浓度为1×106CFU/ml。采用表层镜法建立小鼠真菌性角膜炎模型[2]。
1.2 溃疡刮片镜检与培养。在拆除眼睑缝线当天，随机选取3只小鼠，刮取其角膜溃疡灶，分别进行涂片查菌丝、真菌培养和细菌培养。
1.3 角膜炎形态观察。角膜接种菌液后第1、3、5、7天，裂隙灯显微镜观察角膜炎症变化及其病变特点，如角膜混浊的面积、密度和表面的规则性等。
1.4 实验取材及实验室检测。角膜接种菌液后第1、3、5、7天，自各组中随机选取角膜感染成功的小鼠：（1）2只进行石蜡包埋，待行HE染色组织病理学检查；（2）6只在分别待行Rt-PCR和ELISA检测细胞因子的表达。
1.5 组织病理学检查。角膜组织切片常规HE染色，光镜下观察角膜病理变化、炎症细胞浸润情况。
1.6 半定量RT-PCR检测IFN-γ与T-bet 基因mRNA的表达。
1.7 ELISA检测IFN-γ的表达。按照试剂盒步骤进行操作。1.8 统计学处理。所有统计均在SPSS11.5软件上运行，组内
或组间的比较采用t检验或单因素方差分析（两两比较采用SNK法），T-bet mRNA与IFN-γ的关系采用直线相关回归分析。以P<0.05作为差异有统计学意义的检验标准。
2 结果
2.1 溃疡刮片镜检与培养
小鼠角膜溃疡处刮片后采用10％KOH湿片法均可查见菌丝，真菌培养全部阳性，菌种鉴定均为原感染菌，细菌培养全部阴性。
2.2 角膜炎形态
接种菌液后第1天表现为角膜浅层轻度浸润水肿；以后表浅浸润加重，出现黄白色或灰黄色溃疡灶；第7天角膜致密混浊，周边角膜新生血管大量生长。
2.3 HE染色
接种菌液后第1、3天可见角膜基质及前房有大量的炎症细胞浸润，第5天炎症细胞有所减少，周边可见新生血管，角膜基质中纤维细胞逐渐增多。
2.4 角膜中IFN-γ的表达
RT-PCR及ELISA对角膜中IFN-γ的检测结果表明，在正常角膜中几乎未见表达，而角膜接种菌液后的第1、3天呈高表达，以后逐渐表达减弱。
2.5 角膜中T-bet基因mRNA的表达及其与IFN-γ的相关性
RT-PCR检测结果表明，T-bet 基因mRNA在角膜接种菌液后开始表达，第3天达最高值，而后逐渐降低。
经Pearson相关性分析结果显示，在小鼠真菌性角膜炎发展过程中，角膜中T-bet 基因mRNA的表达与IFN-γ呈正相关(r=0.645，P<0.05)。
3 讨论
已知， Thl细胞主要介导细胞免疫应答，引起前炎症细胞因子（IL-12、IFN-γ，等）的产生，杀灭病原体，与保护性炎症反应有关[3,4]。研究表明，IFN-γ主要由Thl型细胞和NK细胞产生，能促进吞噬细胞和Thl的增殖、活化[5]。本研究中，在角膜感染真菌后，迅速出现IFN-γ的表达，表明Thl型免疫应答积极参与调节机体的抗真菌免疫，且真菌性角膜炎的病程发展与抗真菌免疫平衡密切相关。
本研究显示，IFN-γ在感染初期呈高表达，表明角膜感染真菌后，迅速启动非特异性免疫反应，激活炎性细胞并分泌炎性因子以抵御真菌。在感染后第3天，IFN-γ表达达到最高，提示机体的免疫力可能达最强。此时角膜浸润混浊正进行性加重，在角膜缘、角膜基质及前房中有大量的炎症细胞浸润，表明机体正处于急性感染期。随着病程发展，IFN-γ水平逐渐降低，相对应的临床表现是角膜中炎症细胞逐渐减少，周边大量新生血管生长。我们推测，Balb/c小鼠角膜感染真菌后，机体发生强烈的Th1型免疫应答，诱导炎症反应的发生，以控制和清除真菌的感染。
T-bet是Thl细胞分化的特异性转录因子，能选择性地表达于Thl细胞，与IFN-γ基因的启动子区结合，正调节Thl型细胞因子，是决定Thl极性分化的关键因素[3]。T-bet的表达水平反应了Thl免疫水平。本研究中，T-bet 基因mRNA的表达与IFN-γ相一致，支持我们对小鼠角膜抗真菌免疫的推测。
参考文献:
[1] Cenci E, Mencacci A, Spaccapelo R,et al. T helper cell type 1 (Th1)- and Th2-like responses are present in mice with gastric candidiasis but protective immunity is associated with Th1 development[J]. J Infect Dis, 1995,171:1279-1288.
[2] Hu J, Wang Y, Xie L. Potential Role of Macrophages in Experimental Keratomycosis[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2009,50:2087-2094.
[3] Szabo SJ, Sullivan BM, Stemmann C, et al. Distinct effects of T-bet in TH1 lineage commitment and IFN-gamma production in CD4 and CD8 T cells[J]. Science, 2002, 295(5553):338-342.
[4] Moser C, Jensen PO, Kobayashi O,et al. Improved outcome of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection is associated with induction of a Th1-dominated cytokine response[J]. Clin Exp Immunol, 2002,127:206-213.
[5] Hino R, Shimauchi T, Tokura Y. Treatment with IFN-gamma increases serum levels of Th1 chemokines and decreases those of Th2 chemokines in patients with mycosis fungoides[J]. J Dermatol Sci, 2005,38:189-195.
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