心脏Nmnat过表达联合耐力运动对果蝇高脂膳食诱发脂毒性心肌症的影响

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　　摘    要：利用UAS/hand-gal4系統构建果蝇心脏Nmnat基因特异性过表达，研究心脏Nmnat基因过表达联合耐力运动对高脂膳食诱发脂毒性心肌症的影响，并分析其分子机制。方法：雄性w1118和Nmnat-UAS系果蝇分别与雌性hand-Gal4杂交，收集F1代心脏Nmnat正常表达（hand>w1118）和过表达 （hand>Nmnat）处女蝇，饲养至15 d后开始进行耐力运动（E）和高脂膳食（HFD），并分为hand>w1118、hand>w1118+E、hand>w1118+HFD、hand>w1118+HFD+E、hand>Nmnat、hand>Nmnat+E、hand>Nmnat+HFD、hand>Nmnat+HFD+E共8组，每组410只。ELISA检测心脏TAG、NAD+、SIR2蛋白去乙酰化、SOD活力和MDA水平，qRT-PCR检测心脏相关基因mRNA表达，M-mode检测心脏功能情况。结果：hand>w1118+HFD+E果蝇心脏的Nmnat、dFoxo、bmm表达、NAD+水平、SIR2去乙酰化、SOD活力、缩短分数高于hand>w1118+HFD（P<0.05或P<0.01），且dFAS和Col4al表达、TAG和MDA水平、心率和纤维性振颤低于hand>w1118+HFD（P<0.05或P<0.01）; hand>Nmnat果蝇心脏各指标与hand>Nmnat+HFD相比较未见显著差异（P>0.05）;hand>Nmnat+HFD+E果蝇心脏的Nmnat、dFoxo、bmm表达、心脏NAD+水平、SIR2去乙酰化、SOD活力、心脏缩短分数高于hand>Nmnat+HFD（P<0.05或 P<0.01），且dFAS和Col4al表达＼TAG和MDA水平、心率和纤维性振颤低于hand>Nmnat+ HFD（P<0.05或P<0.01）。结论：心脏Nmnat过表达和耐力运动均能抵抗果蝇高脂膳食诱发的心脏脂质过度堆积、氧化损伤、减弱心脏收缩能力和增加纤维性振颤，其分子机制与心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性增强有关。心脏Nmnat基因过表达联合耐力运动能更好地降低脂毒性心肌症的发生概率，其机制与二者联合对心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性上调的叠加作用有关。
　　关键词：耐力运动;高脂膳食;脂毒性心肌症;Nmnat
　　中图分类号：G 804.2          学科代码：040302           文献标识码：A
　　Abstract：Objective： Constructing the specific overexpression of Nmnat gene in the heart of fruit flies using UAS/ hand-gal4 system to study the effect of the overexpression of Nmnat gene in the heart combined with endurance exercise on lipid toxicity induced by high-fat diet， and to analyze the molecular mechanism. Methods： Male w1118 and Nmnat-UAS fruit flies were respectively hybridized with female hand-gal4. Collecting the normal expression of heart Nmnat （hand>w1118） and the overexpression （hand>Nmnat） of F1 generation female flies. After feeding for 15 days， they began to perform endurance exercise （E） and high-fat diet （HFD）. They were divided into hand>w1118， hand>w1118+E， hand>w1118+HFD， hand>w1118+HFD+E， hand>Nmnat， hand>Nmnat +E， hand>Nmnat+HFD， hand>Nmnat+HFD+E， 410 flies in each group. The levels of cardiac TAG， NAD+， SIR2 protein deacetylation， SOD activity and MDA were detected by ELISA. The expression of cardiac related genes by RT-PCR; M-mode detects cardiac function. Results： the expression of Nmnat， dFoxo， bmm， NAD+ level， SIR2 deacetylation， SOD activity and shortened fraction of hand>w1118+HFD+E group were significantly higher than that of hand>w1118+HFD group （P<0.05 or P<0.01）， but the expression of dFAS， Col4al， TAG and MDA level， heart rate and fibrillation were significantly lower than that of hand>w1118+HFD group （P<0.05 or P<0.01）. There was no significant difference between the heart hand>Nmnat group and hand>Nmnat+HFD group （P>0.05）. The expression of Nmnat， dFoxo， bmm， NAD+， SIR2 deacetylation， SOD activity and shortened heart fraction in the hand>Nmnat+HFD+E group were significantly higher than those in the hand>Nmnat+HFD group （P<0.05 or P<0.01）， but the expression of dFAS， Col4al， TAG and MDA levels， heart rate and fibrillation were significantly lower than those in the hand>Nmnat+HFD group （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion： both overexpression of cardiac Nmnat and endurance exercise can prevent excessive accumulation of cardiac lipids， oxidative damage， decreased cardiac contractility and increased fibrillation induced by high-fat diet. The molecular mechanism is related to the fact that both of them can up-regulate the activity of cardiac Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo pathway. The overexpression of cardiac Nmnat gene combined with endurance exercise can better reduce the occurrence of lipid toxic cardiomyopathy， which is related to the superposition effect of the combination on the up-regulation of cardiac Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo pathway activity. 　　Keywords：endurance exercise; high-fat-diet; lipotoxic cardiomyopathy; Nmnat
　　在哺乳动物和果蝇中，长期高脂膳食能诱发脂毒性心肌症，导致心力衰竭和心脏骤亡风险增加[1-2]。脂毒性心肌症表现出4个主要特征：心脏的脂质堆积过度、脂毒性损伤严重、收缩功能障碍及纤维性振颤增加[3]。果蝇是唯一有心脏的无脊椎动物，在其正常食物中加入30%的椰子油即可制成高脂食物，连续喂食果蝇5 d高脂食物即可诱发脂毒性心肌症[4]。研究表明，将果蝇心脏dFoxo基因特异性过表达能有效抵抗高脂膳食诱发脂毒性心肌症;相反，心脏dFoxo基因敲减能导致正常饮食果蝇的心脏产生脂毒性心肌症[4]，这提示心脏dFoxo基因是调控果蝇脂毒性心肌症的关键基因。烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶（Nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase，Nmnat）是烟酰胺腺苷二核苷酸（NAD）生物合成途径中的关键酶蛋白，在细胞内Nmnat蛋白对NAD合成有重要调控作用[5]。NAD+不仅参与能量代谢，还参与SIR2蛋白去乙酰化，这种去乙酰化有后天修饰和转录因子调控的作用，而且被認为是细胞内代谢状态与自适应转录反应之间联系的分子机制[6]。而在细胞中，SIR2蛋白与NAD+的去乙酰化对Foxo蛋白有上游调节作用[7]。研究还证实在哺乳动物和果蝇中，耐力运动能有效预防和改善脂毒性心肌症，如耐力运动能大量动员脂肪分解和供能，防止心脏脂质堆积[7-8]。此外，运动训练能积极调节心肌细胞内Foxo蛋白，提高心脏的抗氧化能力，减少氧化损伤[9]。耐力运动还能提高骨骼肌和心肌的NAD+水平，以促进电子的传递和能量代谢[10]。因此，这些研究提示Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路可能介导耐力运动预防和改善脂毒性心肌症。
　　为确定Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路是介导运动抵抗脂毒性心肌症的关键通路，本研究选用遗传学的经典模式生物果蝇作为研究对象，首先对心脏Nmnat基因正常表达果蝇进行耐力运动和高脂膳食干预，观察其心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路、心脏氧化应激、脂质代谢及心脏功能的变化，以确定运动抵抗高脂膳食诱发脂毒性心肌症是否伴随心脏Nmnat/NAD+/dFoxo通路活性变化;然后，利用Hand-Gal4/USA系统构建心脏Nmnat基因特异性过表达品系果蝇，并对其进行耐力运动和高脂膳食干预，以证实心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路是否为介导耐力运动抵抗脂毒性心肌症的关键分子通路，旨在为脂毒性心肌症的运动联合基因疗法提供理论基础和新思路。
　　1   材料与方法
　　1.1  果蝇品系
　　本实验所需果蝇品系有：野生型w1118（品系号：3605，来源：Bloomington Drosophila Stock Center）、hand-Gal4（品系号：48396，来源：湖南师范大学心脏发育中心）和Nmnat-UAS-overexpression（品系号：39699，来源：Bloomington Drosophila Stock Center），通过对含UAS和GAL4序列不同品系果蝇的杂交，构建UAS/GAL4系统，对心脏目的基因进行表达调控。所有果蝇放置在恒温23 ℃、恒湿50 %、12 h昼夜循环的环境下培养。
　　1.2  杂交及分组
　　雄性野生系w1118和Nmnat-UAS-overexpression系果蝇分别与雌性hand-Gal4杂交，收集F1代羽化12 h内的处女蝇，分为心脏Nmnat正常表达系（hand-Gal4>w1118和hand>w1118）和心脏Nmnat过表达系（hand-Gal4>Nmnat-UAS-overexpression和hand>Nmnat）。然后，运动训练（E）、高脂膳食（HFD）及二者联合分别干预Nmnat正常表达系和心脏Nmnat过表达系，因此，收集的果蝇共分8组，分别为hand>w1118、hand>w1118+E、hand>w1118+HFD、hand>w1118+HFD+E、hand>Nmnat、hand>Nmnat+E、hand>Nmnat+HFD、hand>Nmnat+HFD +E，每组410只，如图1所示。
　　1.3  运动训练和高脂膳食方案
　　运动训练和高脂膳食均从15 d龄开始（果蝇饲养至3周龄初，心脏生理机能趋于成熟，有利于排除生长发育或衰老对心脏的影响），均持续5 d。运动方案为：运动组果蝇均放到运动装置上，每管20只果蝇，果蝇每次翻转至试管底部后，给予10 s做向上攀爬运动，试管长约8 cm，每天运动1.5 h，持续5 d，训练完24 h后取材。通过观察果蝇攀爬过程中能否跟上翻转速度及是否保持逆重力攀爬和趋光特性来判断是否产生运动疲劳，由于逆重力攀爬果蝇自发的运动，且运动持续时间达到1.5 h才产生疲劳现象，称之为果蝇耐力运动。
　　1.4  正常膳食和高脂膳食配制
　　正常膳食：在锅中加入水、黄豆粉、酵母粉、玉米粉搅匀，并在加热过程中加入琼脂，直至溶液沸腾。沸腾后停止加热，冷却过程中加入蔗糖和麦芽糖，待蔗糖和麦芽糖充分溶解后，加入防腐剂丙酸、对羟基苯，充分搅拌后立即分装于洁净的培养管中，每管培养基厚度约为0.5 cm。
　　高脂膳食：正常膳食中加入30%的椰子油，充分溶解混合。先加入正常饮食的培养基上，约0.3 cm厚，然后将30%椰子油与正常饮食的混合物倒在已凝固的培养基上，约0.2 cm厚，使培养基总厚度约为0.5 cm。
　　1.5  M-mode心动图检测心脏功能的变化 　　将麻醉果蝇在果蝇人工血淋巴（人工血淋巴：果蝇血淋巴配剂、蔗糖、海藻糖按照8∶1∶1的比例制成，4 ℃保存）中暴露心脏，用EM-CCD高速摄像机拍摄果蝇心脏跳动显微影像，拍摄时长为30 s，频率为130帧/s，利用HC-Image 软件记录并处理视频数据，采用半自动光学心动分析软件（semi-automatic optical heartbeat analysis software，SOHA）量化分析果蝇心率（heart rate，HR）、缩短分数（fraction shortening，FS）、舒张直径（diastolic diameters，DD）、收缩直径（sysstolic diameters，SD）和纤维性振颤（fibrillations），以反映果蝇心脏收缩能力和心脏振颤情况。每组取30只果蝇检测心脏功能。
　　1.6 ELISA检测果蝇心脏TAG、NAD+、SIR2去乙酰化、SOD活力和MDA水平
　　每组取60只果蝇心脏放入150 μL PBS+1% Triton-x 中，用以检测心脏TAG水平;每组每个指标取80只果蝇心脏放入150 μL PBS中，用以检测心脏NAD+水平、SOD活力水平和MDA水平。ELISA检测步骤如下：用细胞破碎仪使果蝇心肌细胞破裂，将匀浆液离心：4 000 r/min，15 min，4 ℃，取上清备用;标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL，样本孔中加入待测样本50 μL，3孔重复;空白孔不加;除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min;弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350 μL），静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次;每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min;每孔加入终止液50 μL，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的OD值。以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程（如图2所示），将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。
　　1.7  qRT-PCR检测心脏相关基因 mRNA表达情况
　　每组取80只果蝇心脏放入1 mL的trizol reagen中，加0.25 mL氯仿，离心，条件4 ℃，12 000 g，15 min，吸取上层水至另一离心管中并加入等体积100%异丙醇，-20 ℃放过夜，4 ℃下12 000 g离心10 min，留下RNA沉淀，保存在-70 ℃的75%酒精中。
　　mRNA逆转录：离心管在冰上依次加入5×gDNA Eraser Buffer 2  μL、gDNA Eraser 1 μL、RNase Free dH2O 5 μL，共10 mL混合液，42 ℃反应5 min，去除基因组DNA。在冰上加入5×PrimeScript Buffer2 4 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、RNase Free dH2O 4 μL，轻柔混合后立即进行反转录反应。水浴37 ℃反应30 min，85 ℃反应1 min，并将产物稀释到100 μL，-20 ℃保存。
　　Real time PCR：儀器：Bio-Rad96孔荧光定量RT-PRC仪，试剂：SYBR？誖Premix Ex TaqTM（Takara RR820A）。体系：SYBR？誖Premix Ex Taq（2×）15 μL、PCR Forward Primer（10 μM）0.5 μL、PCR Reverse Primer（10 μM）0.5 μL、ROX 0.6 μL、Template 5 μL、ddH2O 8.4 μL，总体系 30 μL，分三重复孔，每孔10 μL，程序：95 ℃，30 s;95 ℃，5 s;60 ℃，30 s， 总循环40次。
　　引物使用Premiers5.0软件设计，并经NCBI BLAST基因库检索验证，与其他基因无高度同源性，以Rp49 基因为内参。引物由上海生物工程生物制品有限公司合成、纯化，其序列为：Nmnat：F：5’- AGACGATCTGGTGCTGGAGT-3’，R：5’- GTTGTCCGTATAGGCGTGGT-3’;dFoxo：F：5’-AACAACAGCAGCATCAGCAG-3’， R：5’-CTGAACCC GAGCAT TCAGAT-3’; bmm：F：5’-ACTGCACATTTCGCTTACCC-3’， R：5’-GAGAATCCG GGTATG AAGCA-3’;dFAS：F：5’-GGTGAGACCATCGTGGAAGT-3’，R：5’AAT
　　GTCTGCCAAGCCAGAGT-3’;Col4a1：F：5’-CCTGGCTTAAATGGAAACGA-3’，R：5’-TCCTGGTTCACCCTTCTGTC-3’;Rp49：F：5’-CTAAGCTGTCGCACAAATGG-3’，R：5’-AACTTCTTGAATCCG
　　GTGGG-3’。取2μL RNA，逆转录为 cDNA，PCR 扩增后用 2% 的琼脂糖电泳鉴定（如图3所示）。计算基因相对表达量及过表达率。
　　1.8  统计学分析
　　所有数据均用SPSS 17.0统计学软件进行分析，采用多因素方差分析运动、高脂膳食、Nmnat过表达之间是否存在交互作用，并分析其主效应;用LDS比较分析各组指标间差异，所有的数据用平均值±标准差（X±S）表示，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。
　　2    结果
　　2.1  心脏Nmnat过表达、运动训练和高脂膳食对果蝇心脏功能的影响 　　多因素方差分析结果显示：运动、高脂膳食、Nmnat基因过表达对果蝇心率、缩短分数、舒张直径、纤维性振颤和Col4a表达有显著影响（P<0.05或P<0.01）;运动×高脂、运动× Nmnat、运动×高脂×Nmnat对果蝇心率、缩短分数、舒张直径、纤维性振颤和Col4a表达均未见交互作用（P>0.05）;高脂×Nmnat对果蝇心率、缩短分数、舒张直径、纤维性振颤和Col4a表达存在交互作用（P<0.05或P<0.01）。
　　LSD比较结果：与hand>w1118相比，hand>w1118+E果蝇心率减慢（P<0.05），缩短分数增加（P<0.05），收缩直径、舒张直径和纤维性振颤未见显著变化（P>0.05），Col4a表达减少（P<0.05），表达率减少10%;hand>w1118+HFD果蝇心率加快（P<0.01），缩短分数减少（P<0.01），收缩直径未见显著变化（P>0.05），舒张直径减少（P<0.05），纤维性振颤和Col4a表达增加（P<0.05，P<0.01），Col4a过表达率25%;hand>w1118+E+HFD果蝇心脏TAG水平降低（P<0.05），其余各指标未见显著变化。与hand>w1118+HFD相比，hand>w1118+E+HFD果蝇心脏心率加快、缩短分数增加（P<0.01，P<0.05），收缩直径、舒张直径、纤维性振颤和Col4a表达均未见显著变化（P>0.05）。如表1、表2和图4所示。
　　与hand>w1118相比，hand>Nmnat果蝇心脏心率减慢（P<0.05），缩短分数增加（P<0.01），收缩直径未见显著变化（P>0.05），舒张直径增加（P<0.01），纤维性振颤和Col4a表达减少（P<0.05），表达率减少11%。如表1、表2和图4所示。
　　与hand>Nmnat相比，hand>Nmnat+E果蝇心率减慢（P<0.05），缩短分数增加（P<0.05），收缩直径和舒张直径未见显著变化（P>0.05），纤维性振颤和Col4a表达减少（P<0.05），表达率减少22%;hand>Nmnat+HFD果蝇心脏心率加快、缩短分数、收缩直径、舒张直径、纤维性振颤和Col4a表达均未见显著变化（P>0.05）;hand>Nmnat+E+HFD果蝇心率减慢（P<0.05），缩短分数增加（P<0.05），收缩直径和舒张直径未见显著变化（P>0.05），纤维性振颤和Col4a表达减少（P<0.05），表达率减少19%;与hand>Nmnat+HFD相比，hand>Nmnat+E+HFD果蝇心率减慢（P<0.01），缩短分数增加（P<0.05），收缩直径和舒张直径未见显著变化（P>0.05），纤维性振颤和Col4a表达减少（P<0.05）。如表1、表2和图4所示。
　　与hand>w1118相比，hand>w1118+E和hand>w1118+HFD的心脏外径增加（P<0.05），其余各组均未见显著变化（P>0.05），见表3。如图5所示：高脂膳食能明显诱发hand>w1118果蝇心脏外径增大和脂质堆积增多，提示病理性心脏肥大;运动训练和Nmnat过表达同样能使心脏外径增大，但没有出现脂质堆积的现象，提示心脏生理性增大。
　　2.2  心脏Nmnat过表达、运动训练和高脂膳食对果蝇心脏脂质代谢和氧化应激的影响
　　多因素方差分析结果显示：运动、高脂膳食、Nmnat过表达对心脏TAG、bmm表达、dFAS表达、SOD活力、MDA水平、dFoxo表达均存在显著影响（P<0.05或P<0.01）。运动×高脂、运动× Nmnat、运动×高脂×Nmnat对心脏TAG、bmm表达、dFAS表达、SOD活力、MDA水平、dFoxo表达均未见交互作用（P>0.05）;高脂×Nmnat对心脏TAG、bmm表达、dFAS表达、SOD活力、MDA水平、dFoxo表达存在交互作用（P<0.05或P<0.01）。
　　LSD比较结果显示：与hand>w1118相比，hand>w1118+E果蠅心脏TAG水平、dFAS表达和MDA水平均降低（P<0.05或P<0.01），dFAS表达率减少42%，心脏bmm表达、SOD活力和dFoxo表达升高（P<0.01），bmm过表达率39%，dFoxo过表达率84%;hand>w1118+HFD组果蝇心脏TAG水平、dFAS表达和MDA水平均升高（P<0.01），dFAS过表达率85%，心脏bmm表达、SOD活力和dFoxo表达均降低（P<0.01），bmm表达率减少55%，dFoxo表达率减少54%;hand>w1118+E+HFD果蝇心脏TAG水平降低（P<0.05），其余各指标未见显著变化。与hand>w1118+HFD相比，hand>w1118+E+HFD果蝇心脏TAG水平、dFAS表达和MDA水平均降低（P<0.01），心脏bmm表达、SOD活力和dFoxo表达升高（P<0.01），见表4和表5。
　　与hand>w1118相比，hand>Nmnat果蝇心脏TAG水平、dFAS表达和MDA水平均降低（P<0.01），dFAS表达率-46%，心脏bmm表达、SOD活力和dFoxo表达升高（P<0.01），bmm过表达率42%，dFoxo过表达率86%，见表4和表5。 　　与hand >Nmnat相比，hand>Nmnat+E果蝇心脏TAG水平、dFAS表达和MDA水平均降低（P<0.05），dFAS表达率减少56%，心脏bmm表达、SOD活力和dFoxo表达升高（P<0.05或P<0.01），bmm过表达率57%，dFoxo过表达率114%;hand>Nmnat+HFD果蝇心脏TAG水平、dFAS表达、MDA水平、bmm表达、SOD活力和dFoxo表达均未见显著变化（P>0.05）;hand>Nmnat+E+HFD果蝇心脏TAG水平、dFAS表达和dFoxo表达未见显著变化（P>0.05），MDA水平减少（P<0.05），bmm表达和SOD活力升高（P<0.05）。与hand>Nmnat+HFD相比，hand>Nmnat+E+HFD果蠅心脏TAG水平、dFAS表达和MDA水平均降低（P<0.05），dFAS表达率减少52%，心脏bmm表达、SOD活力和dFoxo表达升高（P<0.05或P<0.01），bmm过表达率55%，dFoxo过表达率98%，见表4和表5。
　　2.3  心脏Nmnat过表达、运动和高脂膳食对心脏Nmnat/NAD+/SIR2通路的影响
　　多因素方差分析结果显示：运动、高脂膳食、Nmnat过表达对心脏Nmnat表达量、NAD+水平和SIR2去乙酰化水平存在显著影响（P<0.05或P<0.01）。运动×高脂、运动×Nmnat、运动×高脂×Nmnat对心脏Nmnat表达量、NAD+水平和SIR2去乙酰化水平均未见交互作用（P>0.05）;高脂×Nmnat对心脏Nmnat表达量、NAD+水平和SIR2去乙酰化水平存在交互作用（P<0.05或P<0.01）。
　　LSD比较结果显示：与hand>w1118相比，hand>w1118+E果蝇心脏Nmnat表达增加（P<0.01），过表达率38%，心脏NAD+水平和SIR2去乙酰化水平均升高（P<0.05，P<0.01）;hand>w1118+HFD组心脏Nmnat表达降低（P<0.01），表达率减少29%，心脏NAD+水平和SIR2去乙酰化水平均减少（P<0.01，P<0.05）;hand>w1118+E+HFD果蝇心脏Nmnat表达、NAD+水平和SIR2去乙酰化水平均未见显著差异（P>0.05）。与hand>w1118+HFD相比，hand>w1118+E+HFD果蝇心脏Nmnat表达增加（P<0.01），NAD+水平和SIR2去乙酰化水平升高（P<0.01，P<0.05）。见表6。
　　与hand>w1118相比，hand >Nmnat果蝇心脏Nmnat表达增加（P<0.01），过表达率125%，心脏NAD+水平和SIR2去乙酰化水平均升高（P<0.01）。与hand >Nmnat相比，hand>Nmnat+E组果蝇心脏Nmnat表达增加（P<0.01），过表达率155%，心脏NAD+水平和SIR2去乙酰化水平均升高（P<0.05，P<0.01）;与hand>Nmnat+HFD相比，hand>Nmnat+E+HFD果蝇心脏Nmnat表达增加（P<0.01），过表达率143%，心脏NAD+水平未见显著变化（P>0.05），SIR2去乙酰化水平均升高（P<0.05）。与hand>Nmnat+HFD相比，hand>Nmnat+E+HFD果蝇心脏Nmnat表达增加（P<0.01），心脏NAD+水平无显著变化（P>0.05），SIR2去乙酰化水平均升高（P<0.05）。见表6。
　　3   讨论
　　3.1  高脂膳食对果蝇心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路的影响
　　正常饮食中混入30%的椰子油，连续喂食果蝇5 d，就能诱发其明显可重复的肥胖表型，并造成机体内脂质代谢紊乱，这与哺乳类动物长期高脂膳食的结果类似[1-2]。进一步研究发现，高脂膳食能使果蝇心脏结构和功能异常，例如心脏TAG水平增多，心脏收缩功能减弱等[3]，提示脂毒性心肌症产生。此外，高脂膳食还能导致果蝇心脏dFoxo、PGC-1、甘油三酯水解脂肪酶基因bmm表达下调，心脏TOR、心脏脂肪酸合酶1基因dFAS表达上调等[2-3，11-12]。本研究结果与前人基本一致。此外，笔者还发现高脂膳食导致果蝇的心肌细胞更易遭受氧化毒性损伤，例如抗氧化酶SOD活力减少、脂质氧化毒性物质MDA增加。另外，高脂膳食能引起心脏Nmnat基因表达下调、NAD+水平下降、SIR2去乙酰化水平减少，这可能是高脂膳食导致心脏dFoxo表达下调的重要原因。而高脂膳食能导致心脏胶原蛋白基因Col4a异常上调，则可能是引起心脏纤维性振颤增加的主要机制。
　　在哺乳动物中，长期高脂膳食能破坏脂肪酸代谢平衡，导致未充分氧化的脂质不断沉积于心脏，从而形成脂毒性心肌症[13]。同样，果蝇高脂膳食能诱发心脏TAG水平明显升高，这与脂质代谢平衡破坏有关。一方面心脏甘油三酯水解脂肪酶基因bmm表达下调，减弱脂肪动员和分解[14];另一方面心脏脂肪酸合酶1基因dFAS表达增加，加快心脏内脂质的合成代谢[15]。因此，不断沉积的脂质导致心脏肥大，加重心脏收缩和舒张负担，减弱心脏泵血能力（如图5B和图6C所示），导致心脏需通过增加心率代偿输出量[8，16]。此外，脂质未充分氧化导致脂质毒性损伤，例如抗氧化酶SOD活力减弱，毒性产物MAD水平增加，这可能使心肌细胞膜和线粒体膜的破坏增加，造成心肌细胞收缩能力减弱、泵血功能下降[13，17]。有研究表明，高脂膳食和衰老均能导致心脏胶原蛋白堆积，心肌细胞纤维程度增加，使心脏衰竭风险增加[18]。胶原蛋白是组成各种细胞外间质的聚合物，适量的胶原蛋白有利于细胞的功能，而过量堆积，将使细胞纤维程度增加，果蝇心脏的胶原蛋白合成由Col4a1基因调控[19]。此外，还有研究表明，胶原蛋白表达与脂肪细胞增生有关，脂肪组织分化的一个特点是胶原蛋白积累，而分化成熟时胶原蛋白会停止积累。在发生胰岛素抵抗和代谢相关疾病时，胶原蛋白会选择性增生，而胶原蛋白积累经常被认为是一个病理过程[20];因此，高脂膳食导致果蝇心脏周围脂肪组织分化增加和Col4a1基因表达上调，可能是心脏纤维性振颤增加的主要分子机制[21]。 　　在细胞内NAD+不仅参与能量代谢[10]，还参与脂肪酸氧化的修复[22]，高脂膳食可能促进NAD+参与心肌细胞脂肪酸氧化的修复，加快心肌细胞内NAD+消耗。此外，高脂膳食能使细胞内脂质毒性物质MDA增加，使线粒体结构和功能遭到破坏，这也将导致NAD+水平减少，因为线粒体含有丰富的NAD+   [23]。Nmnat作为NAD+合成酶基因，随着心肌细胞内NAD+水平不断减少，其表达适应性下调。另外，NAD+作为催化物和底物参与SIR2去乙酰化作用，NAD+水平减少降低SIR2的去乙酰化，最终导致dFoxo蛋白活性减少[7]，并使dFoxo基因适应性下调。dFoxo是SOD上游调控因子[24]，dFoxo活性减少能造成SOD水平降低，这将使心肌细胞遭受氧化损伤的风险增加。研究表明，dFoxo基因对脂毒性心肌症形成起着关键性作用[4];因此，高脂膳食诱发的脂毒性心肌症与心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性水平降低密切相关，但仍不能确定该通路是调控脂毒性心肌症的关键通路。
　　3.2  心脏Nmnat基因过表达对高脂膳食果蝇心脏的影响
　　有研究表明，特异性下调果蝇心脏Nmnat基因表达，能引起心脏功能紊乱，例如收缩能力减弱，泵血能力下降等[25]，与脂毒性心肌症特征类似，但心脏Nmnat基因是否参与调控脂毒性心肌症形成。研究已证实果蝇高脂膳食能诱发脂毒性心肌症[2-3，11-12]尚未知，心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性水平降低。为了进一步证实心脏Nmnat基因和心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路与脂毒性心肌症的关系，果蝇心脏Nmnat基因被进行特异性过表达。通过检测心脏Nmnat基因表达，即hand>Nmnat果蝇心脏Nmnat表达明显高于hand>w 1118果蝇，可以判断心脏Nmnat基因特异性过表达构建成功。此外，本研究还发现心脏Nmnat基因特异性过表达能提高果蝇心脏NAD+水平、SIR2去乙酰化水平及dFoxo表达，提示心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性增强。
　　Nmnat是NAD+合成酶基因，是NAD+从头合成途径的关键酶基因，心脏Nmnat基因表达增加，有利于促进NAD+从头合成[5]，从而使心脏NAD+适应性增加。有研究表明，Nmnat过表达能促使NAD+水平适应性增加[26]，而细胞内NAD+对SIR2有上游调节作用，适当提高NAD+水平能上调SIR2表达和提高SIR2蛋白水平[27]，这可能是果蝇心脏内SIR2去乙酰化水平增加的主要原因。心脏内NAD+与SIR2去乙酰化作用能增强Foxo活性水平，导致心脏dFoxo基因表达适应性上调，从而减少氧化损伤[24]。此外，通过检测心脏脂质代谢、氧化应激及心脏功能相关指标，发现心脏Nmnat基因过表达能明显降低心脏TAG水平，这与bmm基因表达上调和dFAS表达下调有关;心脏Nmnat基因过表达能明显增加SOD活力水平，并减少脂质毒性产物MAD水平，提示心肌细胞抗氧化能力增加，细胞膜和线粒体膜遭受氧化损伤风险降低[23-24]，有利于维持心脏收缩功能的稳定。M-mode检测心脏功能发现，心脏Nmnat基因过表达能明显减慢心率，提高缩短分数和增加舒张直径，这反映出心脏泵血能力增强。同时，还发现心脏Nmnat基因过表达能明显降低心脏纤维性振颤，这与心脏Col4a1基因表达和脂质堆积减少有关[21]。果蝇心脏dFoxo基因已被证实是调控脂毒性心肌症的关键基因，因此，心脏Nmnat基因过表达能通过激活心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路来降低脂毒性心肌症发生的风险，但心脏Nmnat基因过表达是否能抵抗果蝇高脂膳食诱发脂毒性心肌症仍未知。
　　为了确定心脏Nmnat基因过表达对果蝇高脂膳食诱发脂毒性心肌症的影响，心脏Nmnat基因过表达果蝇给予高脂膳食。正常情况下，果蝇连续5 d高脂膳食能诱发脂毒性心肌症及心脏分子机制异常改变[1-2]。而在心脏某些基因特异性改变情况下，心脏对高脂膳食诱发脂毒性心肌症的耐受性增强，例如有研究证实，果蝇心脏dFoxo、PGC-1、bmm基因特异性过表达或TOR、dFAS特异性敲减或突变均能抵抗高脂膳食诱发脂毒性心肌症[2-3，11-12]。因此，这些基因均是参与脂毒性心肌症形成的重要基因。本研究发现，高脂膳食不能造成心脏Nmnat基因过表达果蝇心脏脂质堆积和脂肪酸代谢平衡破坏，也未诱发心脏氧化应激增加和心脏收缩能力减弱，纤维性振颤也未见明显改变，相关基因bmm、dFAS、Col4a1、dFoxo也不会出现明显表达异常，心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性维持正常水平。这提示心脏Nmnat基因过表达能提高果蝇心脏对高脂膳食诱发脂质毒性损伤的抵抗能力。心脏Nmnat基因过表达导致NAD+合成适应性增加，一方面充足的NAD+具有还原性能减少脂质氧化不充分导致的脂毒性损伤和保证正常有氧能量代谢，预防脂质堆积[10，22];另一方面充足的NAD+与SIR2去乙酰化能提高Foxo活性，提高SOD水平[24]，提高细胞的氧自由基清除能力，从而减少氧化损伤，维持心肌正常收缩功能[24]。这可能是心脏Nmnat基因过表达通过激活心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路，抵抗高脂膳食诱发脂毒性心肌症的主要原因。
　　3.3  耐力运动联合心脏Nmnat基因过表达对高脂膳食果蝇心脏的影响
　　在哺乳动物和果蝇中，大量研究证实，耐力运动能改善高脂膳食诱发的脂毒性心肌症，包括减少心脏脂质堆积、提高心脏功能、减少氧化应激和增强有氧能量代谢等，其生理机制主要与耐力运动能加快动员心脏内的脂肪，促进脂肪酸氧化分解和供能有关[28]。当然，心脏对耐力运动的适应也有分子水平的变化，例如心臟NAD+水平增加、SOD活力水平升高、dFoxo表达和SIR2表达上调等[8，29]，但心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路是否为耐力运动抵抗脂毒性心肌症的关键通路还未见有研究。 　　为弄清这一问题，本研究对果蝇进行运动干预，发现无论是正常膳食，还是高脂膳食果蝇，进行1周耐力运动后，心脏Nmnat和dFoxo表达显著上调、NAD+水平和SIR2去乙酰化水平明显升高，提示心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性增加。此外，心脏TAG水平下降，bmm基因表达上调，dFAS表达下调，提示心脏内脂肪分解代谢可能大于合成代谢，有利于防止脂质堆积。心脏SOD活力水平增加，MDA水平降低提示心肌细胞抗氧化能力增强，脂质毒性损伤减少。心脏功能方面，心率显著下降，缩短分数和舒张直径增加，提示心脏收缩能力增强;心脏纤维性振颤减少，其生理机制与心脏胶原蛋白合成和脂质减少有关。
　　在进行耐力运动时，心脏对能量的需求非常高，这种刺激可能使运动后的心脏产生适应性变化[30]。NAD+是呼吸链中电子的传递物，NAD+水平高低决定线粒体内外电子传递的速率[23]。运动时，由于心肌细胞氧气供应不足，NAD+不断转化为NADH，NAD+水平不断降低，导致能量代谢效率减低[31]。此外，运动时还会产生氧自由基，由于NAD+具有还原性，因此，NAD+还能消耗自身来抵抗氧化损伤[32]。因此，运动后NAD+水平有可能产生超量恢复，导致心脏NAD+水平适应性增加[33]。NAD+的合成包括从头合成和拯救合成，Nmnat是拯救合成途径中的关键酶基因，CG9940是从头合成的关键酶基因。有研究证实，耐力运动能提高果蝇全身CG9940基因表达[34]。本研究发现耐力运动能上调心脏Nmnat基因表达，这可能是运动后NAD+水平需超量恢复造成的结果。NAD+水平升高不仅使心脏Nmnat基因表达上调，同时还能引起SIR2去乙酰化水平和Foxo活性水平增加，因为NAD+对SIR2有上游调节作用[27]，而SIR2去乙酰化对Foxo活性有上游调节作用[24]，这提示耐力运動可能通过增加NAD+水平上调心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性。进行耐力运动时，脂肪是能量代谢主要物质，这使得脂肪分解代谢相关的酶基因适应性增强，如果bmm表达上调，有利于脂肪动员;同时，脂肪的合成会因为游离甘油三酯水平降低而减少，导致脂肪合成代谢相关的酶基因适应性下调，如果dFAS表达下调[4，35]，这是心脏甘油三酯水平减少的主要机制。耐力运动使心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性增加，还提高了心脏的抗氧化能力，因为Foxo对SOD有上游调节作用[24]，这能减少氧化损伤，使脂毒性产物MDA减少。此外，本研究还发现高脂膳食果蝇进行耐力运动干预后，与正常膳食果蝇相比，心脏Nmnat和dFoxo表达、NAD+水平、SIR2去乙酰化水平、心脏TAG、bmm基因表达、dFAS表达、心脏SOD活力水平、MDA水平降低，心率、缩短分数、舒张直径、心脏纤维性振颤等均未见显著变化。结果提示，耐力运动能有效抵抗高脂膳食诱发的脂毒性心肌症，心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路的激活是其重要机制。
　　不同遗传因素极有可能造成运动效果的差异，例如在果蝇全身CG9940基因过表达、正常表达和敲减的条件下，规律运动对生命周期有促进作用，但在CG9940基因突变的情况下，规律运动能对果蝇寿命产生不利影响[36]。尽管前面已经论证心脏Nmnat基因过表达和耐力运动均能有效抵抗高脂膳食诱发脂毒性心肌症，其机制均与心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路的激活有关，但还不清楚在心脏Nmnat基因过表达条件下，耐力运动对高脂膳食诱发脂毒性心肌症和心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路的影响。本研究结果显示，在心脏Nmnat基因过表达果蝇中，不管是正常膳食还是高脂膳食，耐力运动均能提高果蝇心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性，降低心脏TAG水平，增强心脏抗氧化能力和提高心脏收缩能力，减少纤维性振颤。前面已经阐明心脏Nmnat基因过表达能有效地抵抗高脂膳食诱发脂毒性心肌症，在其联合耐力运动的情况下，这种抵抗性明显增强，其分子机制也与心脏NAD+水平进一步升高、心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性进一步增强有关。
　　4   结论
　　心脏Nmnat基因过表达和耐力运动均能防止果蝇高脂膳食诱发脂毒性心肌症的形成，包括减少高脂膳食果蝇心脏的脂质过度堆积、氧化损伤、心脏收缩能力减弱和纤维性振颤增加，其分子机制与二者均能上调心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性有关。心脏Nmnat基因过表达联合耐力运动时能更好地抵抗脂毒性心肌症的发生，这与二者联合对心脏Nmnat/NAD+/SIR2/dFoxo通路活性上调的叠加作用有关。
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