机械敏感性离子通道蛋白Piezo1在椎间盘髓核细胞中的表达及意义

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　　[摘要] 目的 通过观察机械敏感性离子通道蛋白Piezo1在人椎间盘髓核细胞中的表达情况，初步探讨其在人椎间盘退变中的作用。 方法 收集2017年1月～2018年1月因腰椎退行性疾病在上海市浦东新区公利医院行手术切除的椎间盘组织标本作为实验对象，共收集26例（男15例，女11例），其中PfirrmannⅡ级3例，PfirrmannⅢ级8例，PfirrmannⅣ级15例，根据退变程度分组，将PfirrmannⅡ级的组织标本作为对照组，PfirrmannⅢ、Ⅳ级作为退变组。通过HE染色观察不同退变程度椎间盘的组织学变化，免疫组化检測不同退变程度组织中机械敏感性离子通道蛋白Piezo1的定位及表达水平。 结果 HE染色结果显示，随着椎间盘退变程度增大，髓核细胞外基质含量减少，髓核细胞数量减少，呈不同程度的退变或坏死。免疫组化实验结果显示，Piezo1在对照组和退变组髓核细胞中都有表达，主要在细胞核和细胞质；对照组和退变组的阳性表达率分别为（45.43±13.14）%和（68.75±19.67）%，两组的阳性表达率比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 不同退变程度椎间盘的髓核细胞中有Piezo1表达的现象，且在退变组的Piezo1的表达水平较正常组升高，提示机械敏感性离子通道蛋白Piezo1可能参与了椎间盘中髓核细胞的退变过程。
　　[关键词] 机械敏感性离子通道；Piezo1；髓核细胞；椎间盘退变
　　[中图分类号] R681.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）04（c）-0077-04
　　Expression and significance of mechanically sensitive ion channel protein Piezo1 in nucleus pulposus cells of the intervertebral disc
　　YIN Tao1 SHAO Jin2 ZHANG Yan2 YANG Tieyi2
　　1.Graduate School of Ningxia Medical University， Ningxia Hui Autonomous Region， Yinchuan 750001， China；
　　2.Department of Orthopaedics， Gongli Hospital， Pudong New Area， Shanghai 200135， China
　　[Abstract] Objective To study the expression of Piezo1， a mechanically sensitive ion channel protein in human intervertebral disc nucleus cells， and to explore its role in human intervertebral disc degeneration. Methods A total of 26 specimens （15 males and 11 females） of intervertebral disc tissue surgically removed due to lumbar degenerative diseases were collected in the Shanghai Pudong New Area Gongli Hospital From January 2017 to January 2018. There were 3 cases of Pfirrmann Ⅱ， 8 cases of Pfirrmann Ⅲ， and 15 cases of Pfirrmann Ⅳ. According to the degree of degeneration， Pfirrmann Ⅱ tissue specimens were used as the control group， and Pfirrmann Ⅲ and Ⅳ were used as the degeneration group. HE staining was used to observe the histological changes of intervertebral discs with different degrees of degeneration. Immunohistochemistry staining was used to detect the localization and expression level of mechanically sensitive ion channel protein Piezo1 in tissues with different degrees of degeneration. Results The results of HE staining showed that with the increase of intervertebral disc degeneration， the extracellular matrix content of nucleus pulposus decreased， and the number of nucleus pulposus cells decreased， showing different degrees of degeneration or necrosis. The results of immunohistochemistry showed that Piezo1 was expressed in the nucleus pulposus cells of both the control group and the degenerative group， and the expression was mainly in the nucleus and cytoplasm； the positive expression rates of the control group and the degenerative group were （45.43±13.14）% and （68.75±19.67）%， there was a difference in the positive expression rate between the two groups （P < 0.05）. Conclusion Piezo1 expression was observed in nucleus pulposus cells of intervertebral disc with different degrees of degeneration， and the expression level of Piezo1 in the degenerative group was higher than that in the normal group， suggesting that Piezo1， a mechanically-sensitive ion channel protein， may be involved in the degenerative process of nucleus pulposus cells in intervertebral disc. 　　[Key words] Mechanically sensitive ion channels； Piezo1； Nucleus pulposus cells； Degeneration of intervertebral disc
　　研究[1]表明近80%的人在其一生中都经历过下腰痛（LBP）。腰部疼痛和坐骨神经痛，对患者的生活质量产生了严重的影响，造成了巨大的社会经济负担[2]。在导致LBP的发病原因中，最常见的是椎间盘退变导致退行性椎间盘疾病和腰椎间盘突出症（LDH）[3]。因此，充分了解LDH的发病机制、探讨其治疗方法具有重要意义。
　　年龄、遗传、肥胖、外伤、生物力学等因素均会使腰椎间盘发生退变，进而导致腰背痛、坐骨神经痛等一系列症状[4]，而作为椎体间的连接装置，椎间盘需承受压缩、伸屈、扭转等的力学负荷，异常应力负荷强度的增加、频率紊乱及负载过度都能导致椎间盘病理性改变和损害[5]，因此生物力学因素在LDH的发病中具有重要的影响。Piezo1机械敏感性离子通道蛋白是新发现的一种与细胞生物力学机械信号密切相关的、新型机械敏感性离子通道蛋白。目前关于Piezo1在与生物力学密切相关的椎间盘退变中的作用研究较少。本研究通过收集因腰椎疾病行椎间盘切除治疗的患者的椎间盘组织标本，对其进行组织学检查和免疫组织化学实验，初步探究Piezo1蛋白在椎间盘组织中定位表达的差异，及其与椎间盘退变的相关性，提供治疗和减缓椎间盘退变的新的方法和思路。
　　1 材料与方法
　　1.1样本采集
　　本研究选择2017年1月～2018年1月因腰椎退行性疾病在上海市浦东新区公利医院（以下简称“我院”）手术切除的椎间盘组织标本作为实验对象，共收集26例。其中男15例，女11例；年龄：25～77岁，平均（52.3±12.6）岁；病变节段L3/4 4例，L4/5 13例，L5S1 9例；采用MRI上的T2加权像的Priffmann分级系统进行椎间盘退变程度的分级评估，并排除患有肿瘤，感染，免疫和内分泌疾病的患者。其中PfirrmannⅡ级3例，PfirrmannⅢ级8例，PfirrmannⅣ级15例，纳入患者为腰椎盘源性腰痛、腰椎管狭窄、腰椎滑脱症、LDH进行椎间盘切除和/或腰椎后路椎体间融合术治疗的患者。将PfirrmannⅡ级的组织标本作为对照组，PfirrmannⅢ、Ⅳ级作为退变组。本研究经我院医学伦理审查委员会批准并经患者或家属知情同意，签署知情同意书。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 主要试剂、仪器 二甲苯（国药集团）EDTA（pH 8.0）抗原修复液（Boster）正常兔血清（Boster）苏木素染液（Boster）一抗（Piezo1，1∶50））二抗（1∶2000，Boster）组化试剂盒DAB显色剂（Boster）正置荧光显微镜及成像系统（Nikon Eclipse Ti-SR，日本尼康）病理切片机（RM2016，上海）显微镜（XSP-C204 CIC）组化笔（GT1 001Gene tech）。
　　1.2.2 组织学检查（HE染色法） 将手术中获得的患者的椎间盘组织的标本，在30 min内送到实验室，在无菌条件下对标本进行分离，将髓核组织用生理盐水冲洗干净，置于4%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋固定，切片机连续切片，制备5 μm厚度的石蜡切片，脱蜡水化，利用苏木精-伊红染色法（HE）染色，然后利用显微成像系统拍照观察对照组和退变组的椎间盘组织学特点。
　　1.2.3 免疫组化实验 采用免疫组化Elivison二步法进行实验分析，具体如下：将石蜡切片脱蜡至水；进行抗原修复；阻断内源性过氧化物酶，再用BSA封闭；加入一抗（Piezo1，1∶50），4°C孵育过夜；加二抗，室温孵育50 min；DAB显色；复染细胞核；脱水封片。
　　最后显微镜镜检，图像采集分析。统计计算Piezo1蛋白的阳性细胞表达率=5个视野内阳性染色细胞总数/5个视野内细胞总数×100%。
　　1.3 统计学方法
　　采用SPSS 24.0对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 HE染色检测结果
　　椎间盘组织的病理HE染色结果显示，对照组：髓核细胞外基质丰富，均质淡染，胶原纤维排列略不规则，存在细微的破裂，髓核细胞呈软骨样细胞特点，胞膜完整，形态基本正常或少量异常，髓核细胞内存在不规则的软骨陷窝。退变组：髓核细胞外基质含量明显减少，胶原纤维增粗排列扭曲，排列紊乱，有大量裂隙产生，髓核细胞胞膜不完整，形态异常，细胞核消失，呈不同程度的退变或坏死。
　　2.2 免疫组织化学染色结果
　　对照组和退变组的髓核细胞中都可见到Piezo1蛋白呈棕黄色或棕褐色颗粒的阳性表达，主要定位在细胞内，位于细胞核和靠近核膜的位置，在细胞外基质中几乎没有表达；对照组髓核细胞呈类圆形或梭形，Piezo1蛋白免疫组化染色较浅，呈弱阳性。在退变组的髓核组织中，Piezo1蛋白免疫组化染色较深，呈强阳性（见图2，封四）。对照组和退变组的阳性表达率分别为（45.43±13.14）%和（68.75±19.67）%，退变组椎间盘髓核细胞Piezo1蛋白阳性表达率高于对照组，差异有统计学意义（t = 2.14，P = 0.026）。
　　3 讨论
　　椎间盘是由中心的髓核、外侧的纤维环及上下的软骨终板组成，是一类特殊的软骨组织。髓核是水合凝胶状的结构，其细胞外基质（ECM）富含蛋白多糖和Ⅱ型胶原，在正常椎间盘生理功能中发挥着重要作用[6]。研究[7]表明，正常生理椎间盘中，ECM的合成与代谢处于动态平衡中，当椎间盘发生退变时，髓核外基质合成分解代谢紊乱，蛋白多糖和含水量降低、髓核组织纤维化，Ⅱ型胶原转换为Ⅰ型胶原。引起椎间盘高度下降、组织韧性降低等一系列病理改变。而目前主要通过大体观察法、组织病理学分级法和MRI分级法3种分类方法对椎间盘退变程度进行描述[8]。其中MRI分级法中应用较多的是Pfirrmann分级系统，根据MRI中T2加权像上髓核信號强度、纤维环信号强度、髓核与纤维环界限、椎间盘高度等因素，将椎间盘退变分为Ⅰ～Ⅴ级[9]。本研究根据Pfirrmann分级法对椎间盘退变程度进行分级评估，共分为两组，Ⅱ级可认为是对照组，Ⅲ级和Ⅳ级划分至退变组，HE染色结果表明：组织标本的HE病理结果与Pfirrmann分级评估的判定一致。且随着椎间盘退变程度的增大，髓核细胞外基质含量明显减少，髓核细胞数量减少，胶原纤维增粗排列扭曲、紊乱，有大量裂隙产生，髓核细胞形态异常，呈不同程度的退变或坏死。 　　椎间盘作为上下椎体间的连接部分，在承受身体重量，缓冲压力负荷中发挥着重要作用[10]。在对椎间盘退变机制的研究中，生物力学因素对脊柱的生物代谢活动有着重要的影响。Lotz等[11]研究表明压力的大小、持续时间与椎间盘细胞凋亡率呈正相关，是导致腰椎间盘退变、突出的重要因素。因此对于椎间盘髓核细胞生物力学信号转导机制的研究成为椎间盘退变机制的研究热点。
　　机械敏感性离子通道是一类可以感受细胞膜机械应力的变化并迅速作出反应的离子通道，离子通道的这种反应可以将膜感受到的机械信号转化为电信号或化学信号，从而调控细胞的生命活动[12]。Piezo机械离子通道是2010年Coste等[13]发现的一种新型机械敏感性离子通道，是与生物力学机械信号密切相关的一种离子通路蛋白。脊椎动物存在两种类型的Piezo通道蛋白，即Piezo1和Piezo2蛋白，它们分别由FAM38A和FAM38B基因编码，由2500和2800个氨基酸构成。Piezo1蛋白是拥有24～40个跨膜结构域的巨大跨膜蛋白，Piezo1蛋白在与机械敏感相关的各种细胞类型和器官中广泛表达。例如胃窦G细胞、皮肤、膀胱、肾脏、肺脏、内皮细胞、红细胞和牙根膜韧带细胞等真核细胞[14-16]。但目前在退变髓核组织中是否存在Piezo1蛋白的表达以及在腰椎退变疾病中的作用的相关报道较少。本研究通过免疫组化染色分析Piezo1蛋白在不同退变程度的椎间盘组织中的定位表达情况。结果表明，对照组和退变组中都存在Piezo1蛋白的表达现象，Piezo1蛋白主要定位在细胞内，位于细胞核和靠近核膜的位置都可见棕黄色或深棕褐色颗粒的阳性表达。
　　目前對于Piezo1蛋白功能的研究中，Piezo1在红细胞中的突变与人类贫血和血细胞增多症密切相关[17]。在膀胱中，在尿路上皮细胞中检测到piezo1蛋白在机械拉伸刺激下促进ATP释放，因此其可能参与膀胱延伸的感知[18]。最近的一项研究[19-20]表明，在小鼠的发育中敲除Piezo1基因使血管重塑存在缺陷，导致胚胎致死。由此可见，Piezo1蛋白在生物的生命活动中具有重要作用。另外有学者研究[21-22]表明，在软骨细胞中，Piezo1蛋白与软骨细胞的异常凋亡过程相关，而软骨细胞与椎间盘细胞是同源性细胞，且椎间盘中的髓核细胞的生命活动与生物力学密切相关。本研究首次分析Piezo1蛋白在不同退变程度的椎间盘组织中的表达差异，虽然退变组的椎间盘组织中的髓核细胞的数量较对照组减少，但退变组的髓核细胞中Piezo1蛋白的阳性表达率[（68.75±19.67）%]明显高于对照组[（45.43±13.14）%]，提示Piezo1蛋白在腰椎间盘退变过程中可能发挥重要的调控作用。由于髓核细胞在生物学上是一种类软骨细胞，两者具有相似的细胞生物学特性[23]。因此，我们推测Piezo1蛋白可能参与髓核细胞的异常凋亡生命活动的调控。
　　本研究通过收集不同患者的椎间盘手术标本，将MRI检查与组织学结合，对患者椎间盘退变程度进行评价分析；然后通过免疫组织化学的方法比较对照组和退变组髓核细胞中Piezo1蛋白的表达及定位特点，发现Piezo1在两组髓核细胞中都有表达，且其表达水平与退变程度存在一定的相关性。提示Piezo1蛋白表达的增加可能会加速椎间盘的退变，但本研究还需要更进一步的细胞、动物实验研究来验证两者间的因果关系。
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　　（收稿日期：2018-11-01 本文编辑：封 华）
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