椎间隙感染后持续腰背痛的机制研究

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　　[摘要] 目的 探讨金黄色葡萄球菌上清液对椎间盘髓核细胞蛋白聚糖（ACAN）、Ⅱ型胶原（COLⅡ）的影响。 方法 体外分离培养SD大鼠椎间盘髓核细胞，使用不同浓度（0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%）金黄色葡萄球菌上清液处理，模拟椎间隙感染病程，采用CCK-8检测第二代髓核（P2）细胞增殖活性；采取RT-PCR检测第二代髓核细胞的基因表达量。 结果 本研究发现金黄色葡萄球菌上清液加速髓核细胞去分化，刺激ACAN、COLⅡ表达下降（P < 0.05），上清液浓度>20%时，会明显抑制髓核细胞外基质合成。 结论 经初步研究发现，金黄色葡萄球菌上清液可以抑制髓核细胞生长，且具有浓度依赖性；刺激ACAN、COLⅡ表达减少可能是造成椎间隙感染后持续腰背痛的原因。
　　[关键词] 髓核细胞；椎间隙感染；腰痛；金黄色葡萄球菌
　　[中图分类号] R981.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）05（a）-0008-04
　　[Abstract] Objective To Discus on the Staphylococcus aureus supernatant of intervertebral disc nucleus pulposus cells proteoglycans （ACAN）， type Ⅱ collagen （COL Ⅱ）. Methods Cultured SD rat intervertebral disc nucleus pulposus cells were isolated in vitro and treated with Staphylococcus aureus supernatant at different concentrations （0%， 5%， 10%， 15%， 20%， 25%， 30%， 35%， 40%） to simulate the course of intervertebral space infection. CCK-8 was used to detect the proliferation activity of the second generation nucleus pulposus （P2） cells. RT-PCR was used to detect the gene expression of the second generation nucleus pulposus cells. Results This study found that the supernatant fluid of Staphylococcus aureus that accelerate nucleus pulposus cells to divide， stimulate ACAN， COL Ⅱ expression decreased （P < 0.05）， the supernatant fluid concentration > 20%， can significantly inhibit extracellular matrix synthesis of nucleus pulposus. Conclusion The results showed that Staphylococcus aureus supernatant could inhibit the growth of nucleus pulposus cells in a concentration dependent manner. Stimulate ACAN， COL Ⅱ expression decrease may be the cause of intervertebral infection after continuous low back pain.
　　[Key words] Nucleus pulposus； Spontaneous spondylodiscitis； Low back pain； Staphylococcus aureus
　　椎間隙感染（Spontaneous spondylodiscitis，SS）是一种少见但严重的脊柱疾病，伴有炎症过程，椎体破坏，最终累及椎间盘[1-3]。患者住院时间30～57 d不等，发病率为0.2%～2.0%[4]。有研究[5]表明，金黄色葡萄球菌是最常见的病原菌，占这些病例的40%以上。
　　在成人中，SS通常由脓毒性栓子导致相邻终板缺血梗死、椎体结构破坏、压缩性骨折为主，进而导致椎间盘感染[6-7]。然而，在治疗椎间隙感染过程中，尽管进行了长期的抗生素和外科治疗，但是患者常常出现明显的腰背痛（low back pain，LBP），且其住院治疗时间往往较长[8-10]。目前，金黄色葡萄球菌引起髓核感染和椎间盘炎持续性腰痛的机制尚不明确。髓核细胞一般处于低增殖、低分化状态，损伤后往往难以修复。明显降解髓核细胞外基质（ECM）、聚集蛋白（ACAN）和COL2A1，这些改变都可导致椎间盘结构破坏和功能损害[11-13]。腰痛通常是由椎间盘退变引起的[14-15]。然而，髓核细胞退变与SS之间的关系却报道甚少。本研究旨在通过探讨金黄色葡萄球菌发酵上清液对大鼠髓核细胞去分化的影响，以及可能的腰背痛机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 髓核的收集和培养
　　SPF级健康成年SD雌性大鼠3只，体重250 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2014-0004，动物质量合格证号：114013000 74465。无菌条件下取出脊柱，切除腰椎间盘。将凝胶状髓核用解剖显微镜从纤维环分离，进一步用眼科剪剪碎，0.25%Ⅱ型胶原酶震荡，在37℃消化4～6 h。中和后，离心和重悬于DMEM/F12（20%血清和0.02%青链霉素），37℃ 5%CO2的恒温箱中孵育。培养基每3 d更换1次。当细胞汇合度达90%时，进行细胞传代。在随后的研究中使用第二代细胞（P2）[16]。 　　1.2 金黄色葡萄球菌上清液处理髓核细胞
　　将于-20℃冰箱保存的金黄色葡萄球菌的国际标准菌株ATCC25923取出，复温后种植于普通肉汤培养基（TSB）中。以37℃为发酵温度，摇匀培养20 h，3%为接种标准。使用分光光度计（Evolution 60，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）将悬液TSB稀释至4×107 CFU/mL。4℃ 10 000 g（r = 6.3 cm）离心15 min，其上清液用0.22 μm硝化纖维膜收集和过滤并在4℃储存。简言之，P2和P4髓核细胞分别用0%（DMEM/F12含10%胎牛血清和抗生素）、10%、20%和30%、40%金黄色葡萄球菌上清液处理，每3天更换1次培养基。
　　1.3 细胞增殖实验
　　使用CCK-8试剂盒检测细胞活性。将髓核细胞P2以2000细胞/孔接种在96孔板中培养24 h，然后将培养基去除，以0%（DMEM/F12含10%胎牛血清和0.02%抗生素）、10%、20%、30%、40% 浓度的金黄色葡萄球菌上清液替代。最后，每孔在不同时间点加入10 μL CCK 8试剂，5% CO2 37℃中孵育1 h。在第1、3、5、7天分别用酶联免疫吸附试验阅读器（Thermo Fisher Scientific）于450 nm处检测吸光度，计算细胞存活率。至少重复3次。
　　1.4 RT-PCR
　　样品体积约1 mL室温放置5 min，加入0.2 mL的氯仿，剧烈摇晃15 s，室温放置5 min，4℃，12 000 g （r = 6.3 cm）离心15 min；离心后的液体分成三层，上层是无色的水相，将上层0.5 mL转移到另一干净的EP管中，加入0.5 mL异丙醇，混匀后静置10 min，然后4℃ 12 000 g（r = 6.3 cm）离心15 min；加入0.5 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃ 7500 r/min（r = 6.3 cm）离心5 min，室温干燥RNA沉淀5～10 min，加入无RNase水50 μL溶解RNA，用枪头反复吹打几次，55℃溶解10 min。RNA先用DNA酶处理，去除RNA中含有的基因组DNA，37℃孵育30 min，之后加入1 μL 终止液，然后在65℃孵育5 min，终止反应。纯化后的RNA进行cDNA模板第一链的合成。反转录第一链合成的反应首先将纯化后的RNA 8 μL、随机引物 1 μL和超纯水1 μL，65℃孵育5 min，迅速取出放冰上，静置5 min。然后分别加入反转录缓冲体系5×Buffer 4 μL、MgCl2 3 μL、RNA酶抑制剂0.2 μL、dNTP Mix 1 μL、反转录酶1 μL和超纯水0.8 μL。25℃孵育5 min，42℃反应1 h，70℃ 10 min，之后结束程序。qPCR反应条件：95℃ 2 min，95℃ 10 s、55℃ 30 s、60℃ 30 s共40个循环，熔解曲线生成2 min。引物序列见表1。
　　1.5 统计学方法
　　采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较釆用q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 金黄色葡萄球菌上清液对髓核细胞的刺激作用
　　2.1.1 金黄色葡萄球菌上清液对髓核细胞的细胞毒性作用 为了确定金黄色葡萄球菌对髓核细胞的影响，加入金黄色葡萄球菌上清液的髓核细胞（P2）经离心过滤预接种于96孔板上，分别以0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%浓度培养48 h。结果表明，与对照组比较，10%及以下浓度的金黄色葡萄球菌上清液对髓核细胞活力无影响，而15%的上清液亦无显著影响，但浓度>20%，不同浓度金黄色葡萄球菌上清液可抑制髓核细胞活力（P < 0.05）。见图1。其细胞生长情况。见图2（封四）。
　　2.2 金黄色葡萄球菌上清液对髓核细胞生长的影响和刺激作用
　　采用RT-PCR探讨了金黄色葡萄球菌上清液对髓核细胞的刺激作用。当该上清液浓度>20%时，蛋白多糖、Ⅱ型胶原（COLⅡ）表达下调，抑制细胞合成。这些结果表明，该上清液浓度>20%，髓核细胞合成的功能被完全抑制。见图3。
　　2.3 金黄色葡萄球菌上清液对髓核细胞中ACAN、COLⅡ的表达水平的影响
　　细胞增殖检测的结果见图4。髓核细胞经10%浓度的金黄色葡萄球菌上清液处理7 d后，利用RT-PCR分别检测髓核细胞的ACAN、COLⅡ在10%、20%金黄色葡萄球菌上清液浓度作用下3、7 d的表达量，经处理7 d时ACAN、COLⅡ的表达量明显低于3 d（P < 0.05）。见图5。
　　3 讨论
　　SS多由金黄色葡萄球菌由血液播散引起，目前临床治疗有激素和头孢类抗生素的使用，以及髓核摘除、椎体融合等，但有关椎间盘炎的基础研究很少[1，2，17]。
　　SS的症状以背痛最为常见（85%）[14]。LBP的病理生理原因复杂，髓核细胞退变被广泛认为是导致LBP[18-19]的主要原因之一。正常的髓核细胞外基质的合成和分解代谢平衡的。髓核细胞退变时COLⅠ、COLⅢ表达增强，髓核细胞向去分化表型转变，ACAN和胶原（COLLA2a1）含量降低，可能导致腰背痛[20]。SS患者多存在明显的持续性腰背疼痛，但是，目前尚不清楚髓核细胞是否会因感染金黄色葡萄球菌而发生退变，进而引起腰背痛。
　　本研究发现，在20%金黄色葡萄球菌上清液刺激使用下，髓核细胞ACAN、COLⅡ的表达明显降低。COLⅡ是软骨中主要的结构胶原纤维网络，可提供压缩和拉伸功能强度，ACAN与胶原纤维网络相互作用，使髓核细胞具有压缩刚度[21]。因此，一旦ACAN、COLⅡ的表达减少，髓核细胞抵抗变形和压迫的能力就会大大减弱，进而发生髓核退变，造成腰背痛。然则，对于这些标志物在SS中的改变却鲜有报道。 　　總的来说，这些结果表明，椎间盘感染后引起ACAN和COLⅡ的合成下降，这也许是椎间盘感染患者持续腰背痛的原因。
　　由于椎间盘细胞破坏修复能力差，且抗生素使用效果不佳，目前临床对SS的治疗干预较晚。如果在椎间盘软骨类细胞感染早期即进行治疗干预，能够有效提高软骨细胞存活率，减少软骨基质破坏，甚至可能修复再生健康软骨[22-23]。但是，尽管早期应用抗生素治疗，也可能不能阻止椎间隙感染后椎体破坏的进程。因此，探究SS的早期病理过程，发现其中可介入控制的影响因素及提出早期预后判断指标是椎间隙感染进一步治疗的关键。
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　　（收稿日期：2019-02-02 本文編辑：封 华）
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