MiR-197靶向JAK2调节人皮肤鳞状细胞癌细胞增殖侵袭能力的研究

来源:用户上传      作者:赵思纯

　　[摘要]目的：探討miR-197通过调控JAK2对人皮肤鳞状细胞癌细胞A431增殖和侵袭的影响。方法：收集2018年7月-2019年5月于笔者医院经手术切除且被证实为皮肤鳞状细胞癌的组织标本以及对应的癌旁组织标本各40例，RT-qPCR检测miR-197在皮肤鳞状细胞癌组织、癌旁组织、人正常皮肤细胞系HaCaT、人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431、A431-miR-197-siRNA和A431-miR-197-siRNA-NC中的表达情况;Western-Blot检测JAK2在各细胞株中的表达;生物信息学预测及双荧光素酶报告基因实验验证miR-197和JAK2的靶向关系;MTS法检测miR-197对A431增殖能力的影响;Transwell检测miR-197对皮肤鳞状细胞癌细胞侵袭能力的影响;IFA检测miR-197对上皮间质转化（EMT）相关分子N-cadherin表达的影响。结果：miR-197在皮肤鳞状细胞癌组织和皮肤鳞状细胞癌细胞株A431中的表达水平分别高于癌旁组织和人正常皮肤细胞系HaCaT，差异均具有统计学意义（P<0.05）;与A431和A431-miR-197-siRNA-NC相比，稳定下调细胞系A431-miR-197-siRNA中miR-197、JAK2的表达水平均显著下降（P<0.05）。经Target Scan数据库分析发miR-197和JAK2有互补结合位点。下调miR-197能显著降低皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖和侵袭能力，同时抑制N-cadherin的表达水平。结论：下调miR-197能够靶向抑制皮肤鳞状细胞癌中JAK2的表达和降低EMT相关分子N-cadherin的表达，进而抑制皮肤鳞状细胞癌细胞的EMT进程以及增殖侵袭能力。
　　[关键词]miR-197;人皮肤鳞状细胞癌;癌旁组织;HaCaT;JAK2;增殖;侵袭;上皮-间质转化
　　[中图分类号]R73    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2020）02-0074-05
　　Abstract： Objective  To investigate the effect of miR-197 on proliferation and invasion of human skin squamous cell carcinoma cell A431 by regulating JAK2. Methods  Forty specimens of skin squamous cell carcinoma and forty specimens of corresponding paracancerous tissues were collected from July 2018 to May 2019. The expressions of miR-197 in skin squamous cell carcinoma tissue paracancerous tissue， human normal skin cell line HaCaT， human skin squamous cell carcinoma cell lines A431， A431-miR-197-siRNA and A431-miR-197-siRNA-NC were detected by RT-qPCR. The expressions of JAK2 in various cell lines was detected by western-Blot.  The targeting relationship between miR-197 and JAK2 was verified by bioinformatics prediction and double luciferase reporter gene experiment. Effect of miR-197 on proliferation of A431 was detected by MTS. Effect of MiR-197 on the invasive ability of skin squamous cell carcinoma cells was detected by Transwell. Effect of miR-197 on the expression of N-cadherin， a molecule related to epithelial-mesenchymal transition （EMT） was detected by IFA. Results  The expressions level of miR-197 in skin squamous cell carcinoma tissue and skin squamous cell carcinoma cell line A431 were higher than that in adjacent tissue and human normal skin cell line HaCaT respectively， the differences were statistically significant （P<0.05）. Compared with A431 and A431-miR-197-siRNA-NC， the expression levels of miR-197 and JAK2 in the stably down-regulated cell line A431-miR-197-siRNA decreased significantly （P<0.05）. Analysis of Target Scan database showed that miR-197 and JAK2 had complementary binding sites. Downregulation of miR-197 could significantly reduce the proliferation and invasion ability of skin squamous cell carcinoma cells， and inhibit the expression level of N-cadherin. Conclusion  Downregulation of miR-197 could inhibit the expression of JAK2 and reduce the expression of EMT related molecule N-cadherin in skin squamous cell carcinoma， thus inhibiting the EMT process and proliferation and invasion ability of skin squamous cell carcinoma cells. 　　Key words： miR-197; human skin squamous cell carcinoma; paracancerous tissue; HaCaT; JAK2; proliferation; invasion; epithelial-mesenchymal transition（EMT）
　　皮肤鳞状细胞癌（Squamous cell cancer，SCC）作为皮肤恶性肿瘤，好发部位为颜面、耳部、下唇和手背等曝光部皮肤，亦见于口腔黏膜、唇部、舌部及外阴等部位，成为整形外科常见疾病，该病起源于表皮和皮肤附属器角质形成细胞，其发病机制复杂，尚无有效的治疗措施[1-2]，因此深入研究SCC发生的分子机制，寻求可靠的靶向目标，已成为目前SCC基因治疗的热点。微小RNA（microRNA，miRNAs）是一种具有调控功能的单链小分子，与肿瘤细胞的增殖、侵袭等密切相关[3]。有报道称[4-5]miRNA-197直接参与器质性肿瘤如胃癌、肝癌的形成过程，但未有关于miRNA-197对SCC相关作用机制的报道。因此本研究通过对临床和细胞实验来探讨miR-197对SCC细胞增殖的影响，以期为SCC的诊断和治疗提供新的线索和靶向位点。
　　1  材料和方法
　　1.1 组织标本：收集2018年7月-2019年5月于笔者医院接受手术治疗的40例SCC患者癌组织及其距离癌组织超过2.5cm处的正常组织，术前均未接受化疗或者放疗等治疗措施。所有患者均同意本研究并签署知情同意书，且经医院伦理委员会审核批准展开。
　　1.2 细胞及主要试剂和仪器：人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431及人正常皮肤细胞系HaCaT（中国中科院细胞库），下调miR-197的慢病毒载体siRNA及siRNA-NC（阴性对照）（上海吉玛有限公司）。
　　FBS、RPMI1640培养基（TOYOBO）;Trizol 试剂盒（TaKaRa），MTS细胞增殖试剂盒、western blot试剂盒、Transwell试剂盒（美国BD公司）;反转录试剂盒（美国sigma公司）全蛋白抽提试剂盒（德国QIAGEN公司），Lipofectamine-3 000转染试剂、荧光素酶试剂盒（美国vector公司）;PBS缓冲液（美Amresco公司），青霉素（penicillin， peillin G，100u/ml），链霉素（streptomycin，STC，100μg/ml）（华北制药厂）。Anti-JAK2抗体[4A6]（小鼠单克隆抗体[4A6] to JAK2，ab82539），山羊抗小鼠IgG H&L （HRP）（ab205719），Anti-N Cadherin抗体（兔多克隆抗体to N Cadherin，ab76057），山羊抗兔IgG H&L （Alexa Fluor? 647）预吸附二抗（山羊多克隆抗体二抗to兔IgG-H&L （Alexa Fluor? 647）预吸附二抗，ab150083）均购自Abcam。
　　苏净Airtech超净工作台（北京六一仪器厂），SANYO MCO-15AC细胞培养箱（美国强生公司）;Nikon Ti-U/Ti-s倒置荧光显微镜、电镜（日本三菱公司）;Roche R480实时荧光定量PCR仪（美国Promega公司），Multiskan MK3酶標仪（美国Corning公司）。
　　1.3 RT-qPCR检测组织和细胞中miR-197的表达：依据Trizol法提取皮肤鳞状细胞癌组织、癌旁组织、人正常皮肤细胞系HaCaT、人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431、A431-miR-197-siRNA和A431-miR-197-siRNA-NC样本的总RNA，并进行反转录，按照PrimeScrip反转录试剂盒进行反转录成cDNA，所有操作严格按照试剂盒要求执行。采用SYBR Premix Ex Taq说明书配置PCR反应体系，反应条件为：①预变性：75℃，120s;②变性：90℃，5min;③退火：60℃，60s;④延伸72℃，30s;⑤PCR仪采集荧光信号40个循环，U6作为内参（上游引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物为5’AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’），miR-197（上游引物为5’-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3’，下游引物为5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’），相对表达量用2-△△CT表示。每个样本独立重复实验3次。
　　1.4 Western-Blot检测细胞中JAK2的表达：分别收集HaCaT、A431、A431-miR-197-siRNA和A431-miR-197-siRNA-NC细胞，用总蛋白提取试剂盒提取细胞中总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量。制备蛋白样品并进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后转至PVDF膜，加含有5% BSA的封闭液室温下封闭2h。分别加适量用封闭液稀释的JAK2一抗，之后置于4℃冰箱过夜。次日用PBST将膜冲洗干净，再分别加稀释好的HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗，室温孵育2h，PBST洗膜，加ECL避光作用5min，暗室曝光拍照，同时以GAPDH作为内参蛋白。
　　1.5 生物信息学预测及双荧光素酶报告基因验证miR-197和JAK2的关系：采用miR靶基因数据库Target Scan预测MiR-197和JAK2的结合片段。采用PCR扩增含有miR-197、JAK2结合位点的JAK2片段，并将该扩增片段插入荧光素酶载体psi-CHECK中，构建野生型质粒并记为psi-CHECK-JAK2-wild，同时采用基因突变技术对结合片段中的核苷酸进行突变，并构建突变型质粒psi-CHECK-JAK2-mutant。将miR-197及阴性对照分别与野生型质粒psi-CHECK-JAK2-wild和突变型质粒psi-CHECK-JAK2-mutant共转染至HEK293T 细胞。转染后24h，根据双荧光素酶检测试剂盒说明书测定荧光素酶活性，萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶活性值即为报告基因活性。 　　1.6 MTS法检测细胞增殖能力：调整细胞浓度，以5×103个/孔接种于96孔培养板中，轻轻混匀后，置入37℃，5% CO2培养箱常规培养，于转染成功2d、3d、4d、5d后分别加MTS试剂20μl，37℃避光4h后，弃掉孔内液体，再加DMSO 100μl，置于37℃摇床上快速振荡15min，以便充分溶解结晶物，最后将96孔板置于酶标仪上检测 490nm处的OD值。
　　1.7 Transwell实验检测细胞侵袭：将40μl matrigel基质胶铺于Transwell小室中，37℃静置1h凝固后备用，实验前12h弃原细胞培养液并换成无血清培养基，将细胞消化并用1×PBS清洗，细胞计数后取5×105细胞重悬，取200～250μl细胞悬液至Transwell小室中，下室加入500μl完全培养基，保证下层完全培养基与Transwell小室间无气泡。置于培养箱内培养24h，4%多聚甲醛固定，PBS洗干净，加0.1%结晶紫染液室温避光染色15min，PBS漂洗后用棉棒擦Transwell小室内部，倒置晾干，置于倒置荧光显微镜下观察拍照并计数。
　　1.8 IFA检测上皮间质转化（EMT）相关分子N-cadherin：將A431、A431-miR-197-siRNA和A431-miR-197-siRNA-NC细胞消化后铺至6孔板中，正常培养24h后弃培养基，加4%多聚甲醛固定10min，PBS冲洗后加0.1% Triton100通透15min，PBS冲洗，5% BSA的封闭液室温封闭30min，分别加适量用封闭液稀释的N-cadherin一抗，室温孵育2h，PBS冲洗干净，加稀释好的荧光标记的山羊抗兔IgG二抗于37℃避光作用1h，用稀释好的DAPI染细胞核，封片并置于共聚焦显微镜下观察拍照。
　　1.9 统计学分析：数据统计采用SPSS 19.0软件，作图工具采用Graphpad 5.01，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示具有统计学意义。
　　2  结果
　　2.1 miR-197在组织和细胞中的表达：RT-qPCR结果显示，皮肤鳞状细胞癌组织中miR-197的表达水平高于癌旁组织，差异具有统计学意义（P<0.05）;人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431中miR-197的表达水平明显高于人正常皮肤细胞系HaCaT，差异具有统计学意义（P<0.05）;稳定下调A431-miR-197-siRNA细胞系中miR-197的表达水平显著低于A431和A431-miR-197-siRNA-NC，差异具有统计学意义（P<0.05），提示成功构建稳定下调miR-197的皮肤鳞状细胞癌细胞株（见图1）。
　　2.2 miR-197对JAK2表达的影响：Western-blot结果显示，A431-miR-197-siRNA组中JAK2表达水平明显下降，与A431和A431-miR-197-siRNA-NC相比，差异均具有统计学意义（P<0.05），后两者之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。提示miR-197可正向调控JAK2的表达（见图2）。
　　2.3 miR-197和JAK2关系预测及验证：经www.microRNA.org网站预测发现miR-197和JAK2之间有互补结合序列，提示两者具有靶向调控关系。双荧光素酶报告实验显示，miR-197能显著抑制野生型psi-CHECK-JAK2-wild的荧光素酶活性（P<0.05），而对突变型psi-CHECK-JAK2-mutant的荧光素酶活性无影响（P>0.05），提示MiR-197能特异性结合JAK2。见图3。
　　2.4 miR-197对A431细胞增殖的影响：MTS实验结果显示，与A431和A431-miR-197-siRNA-NC组相比，A431-miR-197-siRNA组细胞在3d、4d和5d时增殖能力明显下降，差异有统计学意义（P<0.001）。提示下调miR-197的表达，可明显抑制A431的细胞的增殖能力，见图4。
　　2.5 miR-197对A431细胞侵袭能力的影响：Transwell小室结果显示，与A431和A431-miR-197-siRNA-NC组相比，A431-miR-197-siRNA组细胞通过matrigel基质胶的数量明显减少，差异具有统计学意义（P<0.05）。提示下调miR-197的表达后，细胞侵袭能力明显减弱，见图5。
　　2.6 miR-197对EMT相关分子N-cadherin的影响：共聚焦显微镜观察发现，与A431和A431-miR-197-siRNA-NC相比，A431-miR-197-siRNA组细胞中N-cadherin表达水平显著下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图6。
　　3  讨论
　　SCC在非黑色素皮肤肿瘤中的发病率仅次于基底细胞癌，约占20%，好发于头面部[6]，研究报道[7]称吸烟、免疫抑制剂、化学致癌物质均为其发病的高危因素，但其发病机制尚不清楚，因此目前缺乏根治性的治疗手段。已有研究证实[8]细胞内多种信号分子调控或者参与SCC细胞的发生及癌细胞的增殖，因此从分子基础生物学角度出发寻找SCC靶向标志物，为患者提供有效的治疗方法有着重要的意义。
　　miRNA近年来被证实对肿瘤细胞的生长周期、凋亡、肿瘤的浸润转移以及新血管生成等均发挥调控作用[9]。miR-197位于染色体lp13.3，Schulte等研究报道miR-197在子宫内膜癌中异常高表达[10]，Nan等[11]研究发现miR-197在肺腺癌中促进癌细胞的侵袭。目前尚无明确的报道研究miR-197的表达与SCC发生发展的关系。本研究发现，miR-197在皮肤鳞状细胞癌组织和皮肤鳞状细胞癌细胞株中呈高表达，提示其在皮肤鳞状细胞癌发生发展过程中起着重要作用。此外，本研究成功构建了miR-197稳定下调细胞系，以进一步证实miR-197对皮肤鳞状细胞癌细胞的影响及作用机制，结果显示与A431和A431-miR-197-siRNA-NC组相比，下调miR-197的表达后，A431-miR-197-siRNA组细胞在3d、4d和5d时增殖能力明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。说明过下调miR-197的表达，可明显抑制A431的细胞的能力，经Transwell实验发现下调miR-197的A431细胞穿过matrigel基质胶的数量显著减少，表明下调miR-197使肿瘤细胞侵袭能力明显减弱。 　　JAK信号通路是细胞内重要的信号传导途径之一[12]，直接参与调控细胞的增殖、分化等，同时JAK家族中的JAK2激酶是目前最具研究前途的抗肿瘤药物靶点[13]。本研究经www.microRNA.org网站预测发现miR-197和JAK2之间有互补结合序列，双荧光素酶报告实验进一步证实miR-197和JAK2能靶向结合。此外，皮肤鳞状细胞癌细胞株A431中JAK2表达水平显著下调，揭示JAK2在皮肤鳞状细胞癌中是一个潜在的肿瘤促进因子。下调miR-197后，A431中JAK2表达水平显著下调，进一步验证miR-197可正向调控JAK2的表达。
　　具有上皮形态和功能的细胞因极性和细胞间连接消失、细胞骨架重排而表现出间质细胞样特征的生理和病理学过程为上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）[14]。EMT是肿瘤细胞从肿瘤母体脱离并向周围组织侵袭以及远处转移的起始，能减弱肿瘤细胞间黏附力，增强其生存及侵入间质的能力，因此EMT被认为是肺癌、胃癌、结直肠癌及乳腺癌等多种实体肿瘤侵袭及轉移的重要进程。神经性钙粘蛋白（N-cadherin）是细胞粘附分子钙粘蛋白家族成员之一，常被作为间质样细胞的标志物，且被证实在多种肿瘤的EMT进程中表达升高[15]。本研究经IFA及共聚焦显微镜观察发现，与A431和A431-miR-197-siRNA-NC相比，下调miR-197的表达后，A431-miR-197-siRNA组细胞中N-cadherin表达水平显著下降（P<0.05）。推测原因，可能是下调的miR-197使肿瘤细胞中JAK2水平下调，广泛促进miRNA的表达和成熟，增强miRNA对肿瘤细胞的调控，使EMT进程及其相关分子N-cadherin的表达受阻，进而抑制肿瘤细胞的侵袭及转移能力。
　　综上，下调miR-197能够靶向抑制皮肤鳞状细胞癌中JAK2的表达和降低EMT相关分子N-cadherin的表达，进而抑制皮肤鳞状细胞癌细胞的EMT进程以及增殖侵袭能力。
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　　[收稿日期]2019-08-09
　　本文引用格式：赵思纯.MiR-197靶向JAK2调节人皮肤鳞状细胞癌细胞增殖侵袭能力的研究[J].中国美容医学，2020，29（2）：74-78.
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