独活寄生汤对胶原诱导性关节炎大鼠免疫功能的影响

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　　[摘要]目的 探討独活寄生汤对胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠免疫功能的影响。方法 50只清洁级雄性Wistar大鼠，适应性饲养7 d后，随机取6只作为正常组，其余大鼠均左足跖部皮内注射胶原乳剂200 μl/只，制作CIA大鼠模型，以关节炎指数（AI）≥4为造模成功。将模型大鼠随机分为模型组、塞来昔布[0.05 g/（kg·d）]组、独活寄生汤高浓度[44 g/（kg·d）]组、独活寄生汤中浓度[22 g/（kg·d）]组和独活寄生汤低浓度[11 g/（kg·d）]组，对照组和模型组采用等体积蒸馏水处理，1次/d，灌胃30 d。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ABC-ELISA）检测并比较6组大鼠血清中的T细胞特异性转录因子（T-bet）、白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）、GATA结合蛋白3（GATA-3）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-13（IL-13）水平。结果 模型组大鼠血清中的T-bet、IL-2和IFN-γ水平高于正常组，GATA-3、IL-6和IL-13水平低于正常组，差异均有统计学意义（P<0.05）;塞来昔布组和独活寄生汤低、中、高浓度组的T-bet水平低于模型组，塞来昔布组和独活寄生汤中浓度组的IL-2水平低于模型组，塞来昔布组和独活寄生汤低、中浓度组的IFN-γ水平低于模型组，塞来昔布组和独活寄生汤低、中、高浓度组的GATA-3、IL-6和IL-13水平高于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 独活寄生汤对CIA大鼠可发挥理想的治疗效果，其抗炎机制通过调节Th1/Th2细胞平衡，使T-bet水平减弱，GATA-3水平增强，抑制免疫炎性因子水平。
　　[关键词]类风湿性关节炎;独活寄生汤;GATA结合蛋白3;T细胞特异性转录因子;免疫功能
　　[中图分类号] R332          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）1（c）-0025-04
　　[Abstract] Objective To explore the effect of Duhuojisheng Decoction on the immune function of collagen induced arthritis （CIA） rats. Methods A total of 50 clean male Wistar rats were fed adaptively for 7 days， six rats were randomly selected as the normal group， the other rats were injected with 200 μl collagen emulsion into the skin of the left plantar part of their feet to make CIA rat model. Arthritis index （AI）≥4 was used as the model successfully. The model rats were randomly divided into model group， Celecoxib （0.05 g/[kg·d]） group， Duhuojisheng Decoction high concentration （44 g/[kg·d]） group， Duhuojisheng Decoction medium concentration （22 g/[kg·d]） group and Duhuojisheng Decoction low concentration （11 g/[kg·d]） group， The control group and model group were treated with distilled water of equal volume， once a day， and gavage for 30 days. The levels of T cell specific transcription factor （T-bet）， interleukin-2 （IL-2）， interferon-γ （IFN-γ）， GATA binding protein 3 （GATA-3）， interleukin-6 （IL-6） and interleukin-13 （IL-13） in serum of six groups of rats were detected and compared by double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay （ABC-ELISA）. Results The levels of T-bet， IL-2 and IFN-γ in serum of the model group were higher than those of the normal group， and the levels of GATA-3， IL-6 and IL-13 were lower than those of the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The T-bet level of Celecoxib group and Duhuojisheng Decoction low， medium and high concentration group were lower than those of model group， the level of IL-2 in Celecoxib group and Duhuojisheng Decoction medium group were lower than those in model group， the IFN-γ levels of Celecoxib group， Duhuojisheng Decoction low and medium concentration group were lower than those of model group， the levels of GATA-3， IL-6 and IL-13 in Celecoxib group， Duhuojisheng Decoction low， medium and high concentration group were higher than those in model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Duhuojisheng Decoction can exert ideal therapeutic effect on CIA rats. Its anti-inflammatory mechanism is to reduce T-bet levels， increase GATA-3 levels， and suppress immune inflammatory factor levels by regulating the Th1 / Th2 cell balance. 　　[Key words] Rheumatoid arthritis; Duhuojisheng Decoction; GATA binding protein 3; T cell specific transcription factor; Immune function
　　类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）属于一类自身系统性慢性疾病，其典型症状为对称性外周小关节炎，主要病理变化为滑膜炎症，最终导致软骨和骨的损伤，病因尚不明确。目前，西医治疗主要运用非甾体抗炎药、糖皮质激素及免疫抑制剂等，不良反应较多。中医药治疗毒副作用小，同时亦可有效缓解西药的不良反应，在治疗RA中发挥着重要作用[1]。独活寄生汤被广泛应用，现代药理学显示，此方剂可发挥一定功效，包括免疫机能的调控、抗炎、镇痛等[2-4];其组方可对胶原诱导性关节炎（collagen induced arthritis，CIA）模型大鼠滑膜组织的病变情况予以有效抑制，相比模型组，病变出现明显改善[5]。大鼠CIA属于一类免疫性炎症，是临床研究RA疾病普遍应用的一类动物模型。近年研究显示，中药治疗具有整体调节、多层次、多靶点的作用[6]，因此，本研究选用独活寄生汤治疗CIA大鼠，以明确相关机制，为本方临床用于治疗RA提供参考。本研究旨在探讨独活寄生汤对CIA大鼠免疫功能的影响，现报道如下。
　　1材料与方法
　　1.1实验动物、试剂和仪器
　　50只清洁级雄性Wistar大鼠，体重240～260 g，购自长生生物技术有限公司（辽宁），合格证号SCXK（辽）2015-0001。大鼠实验操作完全符合医学院动物伦理委员会要求。独活寄生汤配方颗粒剂（批号：8050861）、塞来昔布（批号：AN8170，X41713）均购自齐齐哈尔中医医院;弗氏完全佐剂（FCA）（批号：albr3877v）购自美国Sigma公司;鸡Ⅱ型胶原（批号：181105KE16）、GATA结合蛋白3（GATA-3）（批号：181105KE3）、T细胞特异性转录因子（T-bet）（批号：181105KE4）ELISA试剂盒与白细胞介素-2（IL-2）（批号：181105KE21）、γ干扰素（IFN-γ）、（批号：181105KE8）、白细胞介素-6（IL-6）（批号：181105KE6）、白细胞介素-13（IL-13）（批号：181105KE13）ELISA试剂盒均购自江苏晶美生物科技有限公司。MODEL 550型台式冷冻离心机（德国Eppend-dorf公司），RT-6000 型酶标仪（美国Rayto公司）。水合氯醛（成都德思特生物技术有限公司，批号：DST190826-039）。
　　1.2造模及分组
　　1.2.1 CIA大鼠模型的建立  适应性饲养7 d后，随机取6只作为正常组，其余大鼠建立模型。称取0.5 mg Ⅱ型胶原蛋白（CⅡ）放入0.25 ml醋酸（0.1 mol/L）内，于4℃下搅拌至彻底溶解，终浓度为2 g/L，冰箱（4℃）内经夜放置;添加等体积的FCA，进行乳化反应，制成CⅡ乳剂，终浓度为1 g/L。初次免疫时，经皮内方式将CⅡ由大鼠左足跖部注入，用量为0.2 ml/只，9 d后采取强化免疫处理，注入的CⅡ用量调整为0.1 ml/只，正常组大鼠则将上述试剂调整为等体积生理盐水，共注射15 d，1次/d[7-8]。
　　1.2.2模型的筛选  由初次免疫起，每日对建模动物左后肢肿胀状况进行观察（图1）和评分（0～4级）[9]，关节炎指数（arthritis index，AI）越高，表示其程度越严重。于首次免疫完成后第16 d评估AI值，若AI≥4为造模成功，合计30只。20只造模失败，则弃去[10]。
　　1.2.3分组及干预  将模型大鼠随机分为模型组、塞来昔布[0.05 g/（kg·d）]组、独活寄生汤高剂量[44 g/（kg·d）]组、独活寄生汤中剂量[22 g/（kg·d）]组和独活寄生汤低剂量[11 g/（kg·d）]组，对照组和模型组采用等体积蒸馏水处理，1次/d，灌胃30 d。
　　1.2.4观察指标的检测  给药30 d时处死大鼠，水合氯醛10%麻醉，腹主动脉取血2 ml[11]，给予5 min离心处理，转速为5000 r/min，将上清冻存于液氮内，测定前将标本室温复融混匀，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ABC-ELISA）检测大鼠血清中T-bet、IL-2、IFN-γ、GATA-3、IL-6、IL-13水平，按照试剂盒说明书进行操作。
　　1.3统计学方法
　　采用统计学软件SPSS 20.0分析数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，不符合正态分布的转化为正态分布再行统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1大鼠的一般情况
　　正常组大鼠的精神状态良好，饮水量和进食量均无异常，体重无改变，被毛有光泽，行动正常;模型组大鼠精神萎靡、倦怠，进食量减少，体重减轻，毛发失去光泽，活跃度降低。经药物干预，相比模型组，独活寄生汤组中剂量组的体重升高明显，AI值下降，左后肢足垫厚度明显减小。高剂量组和低剂量组有一定的变化，但变化不明显。
　　2.2独活寄生汤对CIA大鼠血清中T-bet、IL-2、IFN-γ、GATA-3、IL-6、IL-13水平的影响
　　模型组大鼠血清中的T-bet、IL-2和IFN-γ水平高于正常组，GATA-3、IL-6和IL-13水平低于正常組，差异均有统计学意义（P<0.05）;塞来昔布组和独活寄生汤低、中、高浓度组的T-bet水平低于模型组，塞来昔布组和独活寄生汤中浓度组的IL-2水平低于模型组，塞来昔布组和独活寄生汤低、中浓度组的IFN-γ水平低于模型组，塞来昔布组和独活寄生汤低、中、高浓度组的GATA-3、IL-6和IL-13水平高于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。独活寄生汤低、高浓度组的IL-2水平与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;独活寄生汤高浓度组的IFN-γ水平与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。 　　3讨论
　　独活寄生汤来源于《千金方》，包含独活等15味中药。该方是治疗风寒湿痹日久证的常用名方，具有祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血等功效，现代医学主要用其治疗RA等疾病。能抑制白细胞介素的表达而抑制炎症因子对关节软骨的破坏，起到抗炎的作用。RA属于一类自身免疫性疾病[12]，研究显示，在正常免疫机能维持方面，Th1/Th2型细胞与此类细胞产生的细胞因子平衡态发挥着关键作用[13-15]。T-bet为Th1细胞的特异性转录因子[16-17]，Th细胞分化为Th1细胞过程中受到T-bet的调控，主要介导免疫功能，生成如IL-2等促炎因子，导致炎症的发生[18]。GATA-3在Th2细胞内特异表达，为Th2细胞的特异性转录因子[19]，参与每个转录活动，Th2细胞主要介导体液免疫，分泌抑炎因子IL-13等，抑制炎症的发生。
　　本研究结果提示在RA中，大鼠T细胞大多分化为Th1，总的趋势向Th1漂移，破坏Th1/Th2平衡。独活寄生汤干预后大鼠T细胞向Th2分化，同时抑制Th1细胞分化，Th1/Th2的平衡功能得到恢复，此结论与相关研究结果一致[20]。
　　综上所述，独活寄生汤对CIA大鼠可发挥理想的治疗效果，其抗炎机制通过调节Th1/Th2细胞平衡，使T-bet水平减弱，GATA-3水平增强，抑制免疫炎性因子水平。
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　　（收稿日期：2019-08-21  本文编辑：刘克明）
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