miR-27a在骨关节炎治疗中的研究进展

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　　摘 要 越来越多的研究证据表明，miR-27a在骨关节炎（Osteoarthritis， OA）中异常表达并通過NF-κB、PI3K/Ak/ mTOR等多种途径参与调节。在体外试验中，miR-27a能够靶向调控下游特定基因的表达，从而产生对软骨细胞的保护效应，显著抑制关节软骨的病变。随着对miR-27a在OA中的作用机制的深入探索，可以更加精准有效地干预其病理生理进程，有望从根本上改善患者的预后，为未来的临床治疗提供新的思路。
　　关键词 骨关节炎 miRNA 发病机制
　　中图分类号：R684.3 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2020）05-0050-04
　　Research progress of miR-27a for the treatment of osteoarthritis*
　　HU Shunqi**， LI Xilei***
　　（Department of Orthopedics， Zhongshan Hospital， Fudan University， Shanghai 200032， China）
　　ABSTRACT More and more research evidences indicate that miR-27a is abnormally expressed in osteoarthritis and is regulated by various pathways such as NF-κB and PI3K/Ak/mTOR. In vitro， miR-27a is able to target specific genes downstream， resulting in a protective effect on chondrocytes and a significant inhibition of articular cartilage lesions. With the further exploration of the mechanism of miR-27a in osteoarthritis， it is possible to intervene the pathophysiological process more accurately and effectively， which is expected to fundamentally improve the prognosis of patients and provide new ideas for the future clinical treatment.
　　KEY WORDS osteoarthritis； miRNA； pathogenesis
　　microRNA（微小RNA，miRNA）在秀丽隐杆线虫中被发现之后，就引起了学者们的关注。miRNA是一种高度保守的非编码单链RNA，可以在基因转录后水平沉默其同源靶基因。大量报道已经证实，miRNA通过对靶基因的调控，广泛参与多种疾病的生理和病理过程，例如分化、形态发生（morphogenesis）和癌变[1-3]。
　　骨关节炎（osteoarthritis， OA）是一种累及整个关节的复杂疾病，人们至今尚未能完全解释OA的发病机理，临床上也缺乏特异性的有效治疗措施。表观遗传学研究证实，miRNA被认为是导致OA的一个重要因素[4-5]。 microRNA-27a（以下简称为miR-27a）已在肿瘤领域显示出作为药物靶标或生物标志物的巨大潜力，其在OA中发挥的调控作用和应用价值也随着研究的不断深入而逐渐显现出来。本文就miR-27a在OA治疗中的作用机制以及临床应用做如下综述。
　　1 OA的现状
　　OA是一种慢性的、诸多原因引起的关节软骨疾病，其病理特征是慢性炎症下的滑膜关节正常软骨局灶性的丧失、关节组织重塑和滑膜炎性改变[6]。OA会导致患者出现明显的疼痛和运动功能受限。据估计，全世界大约有2.5亿人受到OA的困扰，并且随着人口老龄化的加剧和肥胖人群的迅速增长，OA的发病率会进一步上升[7]。仅在美国，每年对OA成年患者所投入的医疗支出已达到了450亿美元[8]，这对患者家庭以及整个社会无疑是巨大的经济负担。
　　目前有效的OA治疗手段依然非常有限。根据美国骨科医师学会（AAOS）指南，有症状的患者往往只能依靠曲马多或非甾体类抗炎药（NSAIDs）缓解疼痛[9]，最终采取手术方式进行关节置换[10]，而且OA患者经常表现出多种症状，对临床干预的反应也存在着较大差异。这意味着OA是一种异质性疾病，需要为患者提供更加精确的治疗技术[11-12]。面对患者日益增加的医疗需求，传统治疗方法存在着较大的局限性，寻找新的治疗方案成为一个亟待解决的问题。
　　2 OA的发生机制
　　OA的发病机制非常复杂，尚未完全阐明，涉及多种因素，例如遗传易感性、衰老、环境等[13]，上述因素相互交织，共同引发了炎性细胞因子的表达增高，造成了软骨细胞的炎症微环境。当软骨细胞暴露于炎症因子时，又会导致活性氧（ROS）的产生和炎症介质的释放增加[14]，ROS、前列腺素和一氧化氮（NO）等炎症介质通过改变线粒体的功能引起氧化应激和软骨细胞凋亡[15]，产生下游一系列的信号级联反应。最新的研究进展表明，炎症因子IL-1β和TNF-α介导了基质金属蛋白酶（MMPs）和血小板反应蛋白解聚素样金属蛋白酶（ADAMTS）的上调，在基质降解酶的驱动下，软骨细胞的细胞外基质（ECM）的降解大于合成，导致细胞稳态无法维持。随着关节软骨基质蛋白的降解，产生的蛋白降解片段会形成反馈并进一步刺激ECM的破坏[16-17]，继而产生恶性循环。
　　ECM主要由Ⅱ型胶原和蛋白聚糖组成，健康的软骨细胞具有致密的ECM，它可以在生命周期中承受高达300%体重的负荷[18]，这对于负重关节的生物力学特性至关重要。尽管OA是整个关节的疾病，但软骨细胞的细胞外基质（ECM）降解被公认为是正常软骨组织在OA中破坏的基础，也是OA的重要标志[19]。 　　其次，ECM的破坏导致促血管生成因子和抗血管生成因子失平衡，在细胞因子、前列腺素、NO、血管内皮生长因子（VEGF）等促血管因子作用下，造成病理性的血管形成。而软骨基质的降解有助于血管浸润，将无血管的软骨组织转变为高度血管化的骨组织。血管生成伴随着感觉神经的生长，最终诱发OA患者产生疼痛[20]。同时，软骨的血管化也是导致滑膜炎的重要因素之一 [21]。
　　3 miRNAs在调控基因表达中的机制
　　miRNA由一类大小为22至25个核苷酸的非编码RNA分子组成。miRNA利用两种机制与靶基因相互作用：一种是miRNA通过靶向结合信使RNA（mRNA）中的3’-非翻译区域（3’-UTR），从而在转录后水平上以互补序列结合来调节其在细胞质中的表达，最终抑制mRNA的翻译；另一种机制是miRNA通过RNA诱导的沉默复合物（RISC）与其靶基因的互补mRNA结合，通过对mRNA的切割和降解来抑制蛋白的表达。随着miRNAs在疾病演进过程中所发挥的效应被进一步揭示，学者们越来越多地关注miRNAs在病理状态下的异常表达。实验证明，OA病变组织和正常软骨组织的在miRNA表达谱上存在着显著的差异[22-23]。现有的研究证据表明，miR-27a可以作为OA治疗的一个潜在的关键靶标。
　　4 miR-27a抑制OA的作用机制
　　4.1 miR-27a促进软骨细胞增殖
　　Zhang等[24]研究发现，在miR-27a模拟物（mimic）转染细胞的情况下，降低了NF-κB通路相关蛋白的表達，同时CCK-8等方法表明，miR-27a的表达增加，也促进了软骨细胞的增殖。这说明，miR-27a可以通过NF-κB信号通路影响软骨细胞的存活。此外，生物信息学预测和双荧光素酶报告检测验证了miR-27a可以靶向作用于PI3K的3’-UTR区域，通过抑制PI3K/Ak/mTOR的信号通路以激活细胞自噬（autophagy），从而减少了IL-1β处理下的软骨细胞的凋亡率[25]。这表明miR-27a也能够通过影响软骨细胞的自噬水平来调控其增殖。
　　4.2 miR-27a降低炎症因子的表达
　　与对照组相比，miR-27a抑制剂（inhibitor）明显提升了软骨细胞中炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平（P<0.05）；而miR-27a mimic可以有效降低IL-6的表达（P<0.05），虽然无法同时显著降低TNF-α的表达[24]。
　　4.3 miR-27a通过结合Toll样受体4（TLR4）抑制炎症反应
　　在OA患者中，病变区域的软骨细胞TLR4的表达增加，并且TLR4的激活诱导了人和小鼠软骨细胞的炎症与基质的分解代谢，导致基质中Ⅱ型胶原与蛋白聚糖合成减少[26]。由此可见，TLR4在OA进展中起到了关键作用。研究人员通过lncRNA FOXD2-AS1竞争性抑制miR-27a，发现TLR4的水平被上调，进一步的实验表明，TLR4充当了miR-27a的靶标，lncRNA FOXD2-AS1所引起的TLR4蛋白水平表达的增加可以被miR-27a-3pmimic抑制，而且miR-27a可以直接抑制TLR4来减轻炎症和ECM的降解[27]。
　　4.4 miR-27a降低基质降解酶的水平
　　众所周知，MMPs和ADAMTS作为基质降解酶在OA病变中扮演了重要角色，其中MMP-13是最常见的下游靶标之一，其在OA中由于压力或促炎信号而被上调或异常激活[28]。包括促炎因子、生长因子和纤连蛋白片段在内的许多因素可调节MMP-13的表达[29-31]。一系列的研究结果显示，抑制基质降解酶的表达，可以有效缓解软骨细胞的退变，改善软骨细胞的生存。Cheleschi等[32]研究指出，miR-27a可以作用于靶基因MMP-13和ADAMTS-5，降低其mRNA的水平。他们用针对miR-27a的特异性的anti-miRNA转染OA软骨细胞，证实了MMP-13是miR-27a的下游靶基因，这与生物信息学方法预测的结果相符合。
　　4.5 miR-27a抑制滑膜血管的形成、减轻滑膜损伤
　　在对大鼠尾静脉注射miR-27a mimic之后，除了miR-27a表达增高之外，同时伴随PLK2的表达降低。PLK2作为一种关键的抑癌基因，在肿瘤方面的作用被大量报道。在这样的情况下，实验人员通过RT-qPCR在膝关节炎（knee osteoarthritis， KOA）大鼠模型的软骨组织中检测出大鼠膝关节滑膜组织中VEGF mRNA水平下调，免疫组化结果也显示出VEGF蛋白的表达降低。这表明miR-27a能够有效抑制关节滑膜血管的生成。同时，在HE染色的结果中，miR-27a mimic组较之于KOA组而言，软骨细胞表面平坦，细胞分布均匀，软骨裂隙形成减少。进一步研究确定，这些效应由miR-27a靶向调控PLK2基因产生。在KOA大鼠的动物模型中，PLK2在miR-27a的负向调控之下，可以明显减轻血管新生和软骨破坏[33]。
　　4.6 miR-27a可以减轻骨质破坏
　　一项使用OA狗模型的研究结果表明，浓度升高的胰岛素样生长因子结合蛋白-5（IGFBP-5）会导致胰岛素样生长因子-1（IGF-1）水平升高，并且减轻了软骨组织的破坏[34]。Tardif等[35]研究也显示，miR-27a可以调控其下游的IGFBP-5的表达。在这项研究中，IGFBP-5经抗miR-27a处理后48 h开始出现转录水平的上调，在72 h后这种趋势则变得更为显著。有关数据表明，miR-27a并非直接作用于IGFBP-5，而是通过影响其他一个或多个因子的表达来作用于该基因。因此IGFBP-5很可能是miR-27a的间接作用靶标。
　　5 miR-27a在OA治疗中应用的展望 　　盡管许多关于miR-27a在OA模型中的靶向研究获得了较为理想的实验效果，然而迄今为止，还鲜有针对miR-27a的药物被开发出来并投入到OA的临床试验中。但是，在其他疾病领域中尤其是肿瘤治疗方面，已经取得了突破性的进展。一项新的研究结果显示，姜黄素和乳香酸通过下调miR-27a的表达能够对结肠癌进行有效预防[36]；三氧化二砷可以通过抑制乳腺癌细胞的miR-27a来抑减缓肿瘤细胞的增殖和迁移[37]，这些药物均以miR-27a为关键作用靶点。
　　随着miRNA在精准医疗中的优势愈发明显，越来越多的新概念和新技术运用到miRNA相关药物的研发中。罗氏（Roche）公司基于Locked Nucleic Acid研制的MiraVisen是最早进入临床研究的miRNA之一，miRAN Therapeutics公司的MRX34是首个进入临床试验的基于miRNA mimic的产品，另外还出现了以miRNA的反义寡核苷酸作为抑制肿瘤生长的药物[38]。这些跨跃性的成果对OA治疗药物的研发具有重要的借鉴意义。
　　针对miR-27a的大量研究，已经揭示出通过可控的干预措施从基因调控的层面上精确诱导受累的软骨细胞，阻断或延缓其病理生理过程的发展的可能性，相较于传统的治疗方法，基于miR-27a的治疗OA的分子靶向药物的开发具有较佳的应用前景和巨大的潜力。
　　当然，miR-27a在OA的临床应用尚面临一些问题，例如：软骨作为一种无血管的组织，如何将miR-27a在软骨中的作用时间和分布浓度调整至理想水平；在miR-27a涉及众多的下游信号通路的情况下，如何提高miR-27a的靶向作用效果，最大程度减少对其他生理过程的影响。随着miR-27a在OA中作用机制被进一步阐明以及miRNA靶向治疗药物的不断改进，我们有理由相信，在不久的将来，OA的治疗将会开启一个新的大门。
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