P21活化激酶1在肾癌组织中的表达及其临床意义分析

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　　【摘要】 目的 分析P21活化激酶1（PAK1）在肾癌组织中的表达及其临床意义。方法 选取75例肾癌患者的芯片（HKidE150CS03）， 采用免疫组织化学染色方法进行PAK1检测。比较肾癌不同组织（癌旁组织和癌组织）中PAK1阳性检出率及不同分期、不同病理分化程度PAK1阳性检出率。结果 癌组织中PAK1阳性检出率为84%， 高于癌旁组织中的12%， 差异有统计学意义（P<0.05）。Ⅰ～Ⅱ期患者PAK1阳性检出率为77.36%， Ⅲ～Ⅳ期患者PAK1阳性检出率为100.00%;Ⅲ～Ⅳ期患者PAK1阳性检出率高于Ⅰ～Ⅱ期患者， 差异有统计学意义（χ2=5.930， P<0.05）。病理高分化患者PAK1阳性检出率为92.59%， 中低分化患者PAK1阳性检出率为89.58%， 比较差异无统计学意义（χ2=0.185， P>0.05）。结论 PAK1蛋白在肾癌的发生发展和浸润转移中有促进作用， PAK1高表达可能成为肾癌诊断、侵袭性和预后判断的重要生物学参考指标， 因此临床检测中， 可将PAK1蛋白表达水平作为肾癌发展程度的预测因子。
　　【关键词】 肾癌;P21活化激酶1;癌旁组织;肾癌组织
　　DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.09.019
　　肾小管上皮出现恶性肿瘤称为肾癌， 其发病率在肾脏类肿瘤中高达90%。近年来随着我国人口老龄化的上升， 肾癌发病率呈现逐年上升趋势， 其中男性肾癌发病率为6.09/10万， 女性肾癌发病率为3.84/10万[1]。肾癌发生初期并无明显症状， 随病情发展患者有血尿或镜下血尿情况， 患者确诊时多为癌症晚期， 已错过最佳治疗时机[2]。鉴于此近年来研究人员致力于肾癌分子标记物诊断的研究， 将癌旁组织、肾癌组织中小分子物质水平进行比较， 发现PAK1在肾癌组织中呈现出高水平表达， PAK1对肌球蛋白轻链激酶（MLCK）、肿瘤抑制因子有磷酸化作用， 达到促进癌细胞繁殖的目的[3， 4]。因此本研究验证PAK1在肾癌组织中的表达情况， 并进一步分析PAK1的表达与临床意义， 详细报告如下。
　　1 资料与方法
　　1. 1 一般资料 选取上海芯超生物科技有限公司75例肾癌患者的芯片（HKidE150CS03）作为研究对象， 其中男51例， 女24例;年龄34～82岁， 平均年龄（56.5±11.1）岁;肿瘤直径：<7 cm 45例， 7～10 cm23例， >10 cm 7例;临床分期：Ⅰ期35例， Ⅱ期18例， Ⅲ～Ⅳ期22例;病理分化程度：高分化27例、中低分化48例;肿瘤部位：左肾36例， 右肾38例， 肾上1例。
　　1. 2 方法
　　1. 2. 1 仪器、试剂准备 兔抗人PAK1多克隆抗体， 由上海信裕生物技术有限公司提供;荧光定量PCR试剂盒， 由北京众智领先科技有限公司提供， 该公司同时提供定量PCR检测仪。此外需准备辣根过氧化物酶标记鼠抗人β-肌动蛋白单克隆抗体、ImageQuant LAS 4000化学发光图像成像系统等设备。准备完成检测设备、试剂完好程度， 并进行试检测。
　　1. 2. 2 免疫组化法 即对细胞组织切片、染色， 标记PAK1蛋白， 观察其表达情况。具体检测步骤如下：蜡封组织直接切片， 进行脱蜡操作， 水化同时进行高压抗原修复， 恢复细胞组织状态。加山羊血清、过氧化氢（3%）实施封闭操作， 将细胞组织置于4℃环境下， 放置一夜， 孵育二抗1 h， 用对二甲胺基偶氮苯（DAB）染色后显色， 再用苏木精重复染色操作， 脱水处理同时封片。染色后若PAK1蛋白表达水平高且检测结果为阳性， 染色呈棕褐色、黄色。将染色细胞置于显微镜5倍视野下观测， 记录阳性细胞数量。染色强度评分：无色0分;浅黄色1分;黄色、棕色2分;棕褐色3分;>2分即为PAK1阳性。
　　1. 2. 3 PAK1水平表达检测 采用Western印迹检测法， 步骤如下：对细胞组织作特殊处理， 将其蛋白质完全提取出来， 用蛋白质定量法（BCA）检测蛋白浓度。试样作离心处理， 取上清液35 μg， 进行电泳、转膜与封闭操作， 在4℃室温下完成一抗孵育。试样中加入二抗完全混合均匀， 用ECL发光液进行显影操作， 放置于全自动系统中得到相应蛋白质检测条带。
　　1. 3 观察指标 ①统计比较肾癌患者PAK1在肾癌不同组织（癌旁组织和癌组织）中的阳性检出率。②比较不同分期及不同病理分化程度肾癌患者PAK1阳性检出率。
　　1. 4 统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件进行数据统计分析。计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
　　2 结果
　　2. 1 PAK1在肾癌不同组织中阳性检出率比较 癌组织中PAK1阳性检出率为84%， 高于癌旁组织的12%， 差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
　　2. 2 不同分期及不同病理分化程度肾癌患者PAK1阳性检出率比较 Ⅰ～Ⅱ期患者PAK1阳性检出率为77.36%， Ⅲ～Ⅳ期患者PAK1阳性检出率为100.00%;Ⅲ～Ⅳ期患者PAK1阳性检出率高于Ⅰ～Ⅱ期患者， 差异有统计学意义（χ2=5.930， P<0.05）。见表2。病理高分化患者PAK1阳性检出率为92.59%， 中低分化患者PAK1阳性检出率为89.58%， 比较差异无统计学意义（χ2=0.185， P>0.05）。见表3。
　　3 讨论
　　近年来人类饮食结构、生活方式等变化较大， 肾癌发病率呈现上升趋势， 最新统计数据显示， 我国肾癌发病率位居泌尿系统肿瘤第二位。在全球范围内肾癌发病率在成年人恶性肿瘤中占比3%， 且发病率呈现明显的地域差异[5]。为控制肾癌发生率， 国内外学者不断深入探究其病因， 目前肾癌已知病因分析如下。①遗传因素。研究显示肾癌多由常染色体显性遗传为主， 父亲或母亲患有肾癌， 其后代中出现肾癌几率明显高于正常人， 据统计遗传性肾癌在所有患者中占比不高， 仅4%左右[6]。②诱发因素。肥胖是业界公认的诱发肾癌的危险因素之一， 随着体重指数的增加， 肾癌发生率就越高;吸烟也是导致肾癌的危险因素之一， 大量临床实践研究证实， 有吸烟史人群患上腎癌的相对危险度为1.3。③高血压、获得性囊性肾脏疾病也是肾癌发生的高危因素[7， 8]。目前临床治疗水平不断提升， 肾癌诊断从晚期逐渐向早期过度， 通过对Ⅰ类蛋白酶、Ⅱ类蛋白酶等的研究， 发现PAK1蛋白与癌细胞组织发展程度有关。 　　肾癌患者临床表现极其复杂， 癌细胞激素分泌水平与病灶的不断转移使患者呈现出多种表现。肾癌具有较长潜伏期， 其特点是增殖快， 具有侵袭性与进展性。PAK1蛋白在不同临床分期的表达水平有一定差异性， 于俊杰等[9]在研究中指出， P21活化激酶4（PAK4）在肾细胞癌中呈现高表达状态， PAK1蛋白与PAK4蛋白表达具有一定相似性， 采用免疫组织化学两步法进行检测， 结果显示PAK4蛋白在临床分期T1、T2、T3～4期癌组织中的阳性表达率分别为59.3%、90.5%、100.0%， 可见随着分期的增加PAK蛋白呈现出递增趋势。这与本次研究结果一致， 本次研究结果显示， Ⅰ～Ⅱ期患者PAK1阳性检出率为77.36%， Ⅲ～Ⅳ期患者PAK1阳性检出率为100.00%;Ⅲ～Ⅳ期患者PAK1阳性检出率高于Ⅰ～Ⅱ期患者， 差异有统计学意义（χ2=5.930， P<0.05）。病理高分化患者PAK1阳性检出率为92.59%， 中低分化患者PAK1阳性检出率为89.58%， 比较差异无统计学意义（χ2=0.185， P>0.05）。本次研究采用肾癌组织、癌旁组织作为研究对象， 利用免疫组化方法对PAK1在肾癌细胞组织中的表达水平进行检测。检测显示， 癌组织中PAK1阳性检出率为84%， 高于癌旁组织中的12%， 差异有统计学意义（P<0.05）。刘耀雷、孔垂泽、黄耿等[10-12]对Polo样激酶1、蛋白激酶Cα在肾癌组织中的表达情况进行分析， 检测肾癌组织、癌旁组织中酶蛋白的表达， 发现癌旁组织中阳性检出率明显低于肾癌组织， 这与本研究结果一致。经研究发现Polo样激酶1、蛋白激酶Cα的表达与PAK1蛋白在肾癌组织中的表达呈现出协同性， 因此将其与本研究作对比， 相似度较高[13， 14]。
　　综上所述， PAK1蛋白在肾癌的发生发展和浸润转移中有促进作用， PAK1高表达可能成为肾癌诊断、侵袭性和预后判断的重要生物学参考指标， 因此临床检测中， 可将PAK1蛋白表达水平作为肾癌发展程度的预测因子。
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　　[收稿日期：2020-01-09]
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