食管癌CTNNB1及血清CYFRA211与近期放疗疗效的关系

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　　摘要 目的 探讨食管癌患者放疗前血清肿瘤标志物水平及食管癌组织中CTNNB1表达水平与放疗疗效的关系，为预测食管癌放疗疗效寻求更加便捷，廉价的肿瘤生物学指标。方法 入组60例患者，均为不能接受手术的局部晚期患者，经食管镜咬检病理诊断为食管鳞癌，根据患者放疗的近期疗效分为放疗有效组与放疗无效组，每组30例。于放疗前检测患者血清细胞角蛋白19片段（fragments of cytokeratin-19，CYFRA211）水平，采用免疫组织化学二步法检测上述咬检食管癌组织中CTNNB1的表达。应用非参数分析放疗前血清CYFRA211、食管癌组织CTNNB1表达水平与放疗疗效的关系;相关性分析血清肿瘤标志物CYFRA211水平与CTNNB1表达的相关性。结果 放疗有效组血清CYFRA211的表达水平低于无效组，差异有统计学意义（Z=-2.048，P=0.041）;放疗有效组食管癌组织CTNNB1表达水平低于无效组，差异有统计学意义（Z=-2.156，P=0.031）。Spearman相关分析结果提示，患者血清CYFRA211与组织中CTNNB1表达之间存在正相关关系（r=0.622，P<0.001）。结论 食管鳞癌患者中血清CYFRA211或癌组织中CTNNB1表达视屏升高近期放疗疗效较差。患者CTNNB1及血清CYFRA211有望成为可预测食管鳞癌放疗疗效的肿瘤标志物。
　　关键词 食管癌;放疗治疗;CTNNB1;CYFRA211
　　中图分类号  R735.1    文献标识码  A    文章编号  1671-0223（2020）10-042-04
　　中国为食管癌的高发区，食管癌主要以鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）为主。近年来，随着放疗技术的发展，放射治疗已经成为食管癌主要治疗手段之一，但是放射抵抗的存在严重制约放疗疗效提高。寻找具有指导意义的肿瘤标志物对评价放疗效果及病情转归具有非常重要的临床价值。目前针对食管癌的肿瘤标志物较少，且特异性不明显，细胞角蛋白19片段（fragments of cytokeratin-19，CYFRA211）為细胞角蛋白中间体亚单位之一，是人体细胞角蛋白可溶性片段，与鳞状细胞癌密切相关的肿瘤标志物之一[1]，且存在获取便捷等优势。CTNNB1为Wnt通路的标志性蛋白，前期课题组证实Wnt通路活化可能与食管癌放射抵抗相关。但是检测CTNNB1存在组织标本获取困难、有创、造价高等缺点。本文以接受根治性放射治疗的食管鳞癌患者为研究对象，分析血清CYFRA211水平与食管癌组织中CTNNB1的表达水平及近期疗效的关系，为预测食管癌放疗疗效寻求更加便捷，廉价的肿瘤生物学指标。
　　1 对象与方法
　　1.1研究对象
　　选择2010 年1月—2016年 12 期间唐山市人民医院病理诊断为食管鳞癌的患者为研究对象。根据组间基线特征具有可比性的原则，选择放疗有效（有效组）和放疗无效（无效组）患者各30例。纳入条件：①治疗前 KPS 评分均大于 70 分且无严重其他疾病，无明显放疗禁忌证。②全部患者放疗前均未行手术治疗及化疗，选择根治性放疗，放疗为三维适形放射治疗。排除条件：因化疗药物影响疗效观察的及放化同期的患者不纳入实验。
　　1.2 血清CYFRA211检测方法
　　采集两组晨起空腹静脉血3mL，分离血清，以 3000r/min 离心5min，分离血清保存于-80℃ 待用。采用微粒酶联免疫测定法（ MEIA） 检测CYFRA211。操作步骤严格按照仪器和试剂盒说明书进行。
　　1.3 组织CTNNB1检测方法
　　采用免疫组织化学二步法检测食管癌CTNNB1的表达。用已知阳性切片作阳性对照，阴性对照用PBS 代替一抗，由专业病理医师诊断。CTNNB1鼠抗人单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。PV-9000 免疫组织化学二步法检测试剂盒及DAB 显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
　　1.4 免疫组织化学结果判定标准[2]阳性结果判定
　　CTNNB1为棕黄色颗粒，定位于胞质和胞核中。每例选择 2 个高倍视野（×400），每个视野计数 200 个细胞。根据染色强度和染色阳性细胞所占百分比进行结果判断： 阳性细胞所占百分比< 25% 为1分，25%～50% 为 2 分，50%～75% 为3分，>75% 为4分;染色强度不着色为 0 分，1 分为浅棕黄色，棕黄色为 2 分，棕褐色为3分;以染色阳性细胞百分比评分与染色强度评分相乘判断结果。
　　1.5 靶区勾画及放疗方法
　　肿瘤靶区（GTV）：食管壁厚度>0.5cm 或不含气腔的管壁直径>1.0cm，及肿大淋巴结，纵隔淋巴结阳性标准为短径≥1.0cm，特殊部位如食管旁、气管食管沟等淋巴结标准为短径≥0.5cm，并参考食管钡剂造影;临床靶区（CTV）：GTV 头脚方向各外扩2cm，前后左右方向各扩0.8cm，解剖屏障适当修正;计划靶区（PTV）：CTV 头脚方向外扩1cm，前后左右扩0.5cm。三维适形放疗，常规分割2.0 Gy /次、近似剂量60～66 Gy /30～33次。
　　1.6 放疗近期疗效评价标准
　　放疗近期疗效的评价参照1989年万钧提出的食管癌放射治疗后近期疗效的评价标准[3]，放射治疗结束1～3月后由两位经验丰富的放疗科主任医师分别进行近期疗效的独立评价，评价不一致时进行协商讨论。完全缓解（CR）：肿瘤完全消失，食管片边缘光滑，钡剂通过顺利，但管壁可稍显强直，管腔无狭窄或稍显狭窄，粘膜基本恢复正常或增粗;部分缓解（PR）：病变大部分消失，无明显的扭曲或成角，无向腔外溃疡，钡剂通过尚顺利，但边缘欠光滑，有小的充盈缺损或小龛影，或边缘虽光滑但管腔有明显狭窄;无缓解（NR）：放疗结束时病变有残留或看不出病变有明显好转，仍有明显的充盈缺损及龛影或狭窄加重。CR + PR 为放疗有效组，SD + PD 为放疗无效组。 　　1.7 统计学分析
　　采用 SPSS 10.0 统计软件包对数据进行处理。非正态分布的计量资料计算中位数及P25，P75，组间中位数比较采用非参数Mann-Whitney U检验;计数资料组间比较采用χ2检验;CYFRA211 与CTNNB1表达的相关性采用线性相关分析。 P<0.05为差异具有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 放疗有效组与无效组基线特征比较
　　两组性别、年龄、病变长度、淋巴转移、病理分级等基线临床特征比较，差异无统计学意义（P<0.05），具有可比性，见表1。
　　2.2血清CYFRA211及癌组织中CTNNB1的表达水平与近期疗效的关系
　　放疗有效组血清CYFRA211、CTNNB1的表达水平均低于放疗无效组，差异具有统计学意义（P<0.05），表明血清CYFRA211、CTNNB1的表达水平与近期疗效有关系，表达水平升高，放疗疗效较差，见表2。
　　2.3 血清CYFRA211与癌组织中CTNNB1表达的相关性
　　Spearman相關分析结果显示，血清CYFRA211与癌组织中CTNNB1之间存在正相关关系（r=0.622，P<0.001），且关系较为密切。
　　3 讨论
　　放射治疗是目前食管癌主要治疗手段之一，尤其是对于无法接受手术的食管鳞癌患者。然而放射治疗后肿瘤的局部未控及局部复发是目前阻碍放疗疗效提高的瓶颈。增加放疗剂量不能改善局部控制率与生存期，这表明肿瘤存在着放射抵抗。课题组前期研究发现CTNNB1可能与食管癌细胞的放射抵抗相关[4]，本文通过探讨食管癌放疗前血清肿瘤标志物水平与食管癌组织中CTNNB1表达的相关性及与放疗疗效的关系，可为预测食管癌放疗疗效寻求更加便捷，廉价的肿瘤生物学指标。
　　CYFRA211是人体细胞角蛋白的片段，恶性肿瘤细胞中多有表达，并与肿瘤细胞正相关，当人体鳞状上皮细胞引起恶变时，其蛋白酶易被激活，使角蛋白片段大量生成从而进入人体血液循环中，使人体CYFRA211含量显著升高。CYFRA211在食管癌中也有研究，但是表达情况及作用尚存在争议。有研究显示CYFRA211和癌胚抗原（CEA）可能有助于预测原发灶食管鳞状细胞癌对化学放疗的反应性[5]。对于CYFRA211与放射治疗敏感性的关系存在争议，有研究显示食管鳞状细胞癌放射治疗的疗效与治疗前血清CYFRA211显著相关，CYFRA211水平高的患者的总体生存较CYFRA211水平低的患者的总体生存差，CYFRA211的低水平是良好总体生存最重要的独立预测因子[6]。但是在另一项研究结果中显示CYFRA211的血清表达水平与预后无关[7]。本文结果显示，相对于放疗有效组，放疗无效组的 CYFRA211 升高，差异有统计学意义。
　　CTNNB1 是 Wnt/β-catenin信号通路的关键成分，在该信号通路中充当第二信使的作用。近年来有学者发现，一些细胞调控因子及原癌基因也可通过 Wnt/β-catenin信号通路异常激活来促进细胞增殖、分化，进而导致肿瘤发生。CTNNB1则作为经典Wnt信号传导通路的关键点与转录因子Tcf/Lef 结合形成复合体促进靶基因上调，最终引起细胞发生一系列的生物学改变。在肿瘤放射学方面，Wnt/β-catenin信号通路因其会影响肿瘤细胞的增殖[8]、凋亡[9]、DNA损伤修复[10-11]等方面从而参与了肿瘤放射抗性形成。课题组前期研究发现CTNNB1可能通过Wnt/β-catenin信号通路的活化调控细胞周期而参与食管癌细胞的放射抵抗进程[12]。本实验结果提示，CTNNB1表达与肿瘤细胞的胞浆及胞核，放疗有效组与无效组间CTNNB1表达差异具有统计意义，分析结果与前期实验结果相符。
　　综上，患者血清CYFRA211在呈现放射抵抗性的食管癌患者中高表达，课题组推测CYFRA211可能存在着相关性关系。通过相关性分析实验结果证实，食管鳞癌患者中的血清CYFRA211值和组织中的CTNNB1表达量确实存在相关性。据此课题组分析，CYFRA211和CTNNB1可能通过某条相同或存在上下调控关系的分子通路在食管鳞癌中发挥放射抵抗作用，但是其具体机制需进一步分子生物学实验探索。血清CYFRA211有望成为可预测食管鳞癌放疗疗效的肿瘤标志物。
　　4 参考文献
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　　[2020-05-15收稿]
　　基金项目：唐山市科技局计划项目（编号：17130238a）
　　作者单位：063000 河北省唐山市人民医院
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