山慈菇含药血清对人乳腺癌SK-BR-3细胞增殖、凋亡以及迁移能力影响的实验研究

来源:用户上传      作者:陈思 邢晓静

　　摘要：目的 观察山慈菇含药血清对人乳腺SK-BR-3细胞增殖、凋亡以及迁移能力的影响。方法 选用20只SD雌性大鼠，2月龄，体重（200±20）g，使用随机数字表法将大鼠随机分为实验组和空白对照组，每组10只，实验组大鼠按0.01 mL/g灌胃山慈菇浓煎剂，对照组大鼠给予等体积的生理盐水，每日灌胃1次，连续6d，末次灌胃后，腹主动脉取血，制作含药血清;同时培育人乳腺癌SK-BR-3细胞。使用MTT法检测人乳腺癌SK-BR-3细胞增殖情况、荧光显微镜观察SK-BR-3凋亡情况以及划痕试验检测SK-BR-3细胞迁移情况。结果 与对照组比较，实验组能够明显抑制人乳腺癌SK-BR-3细胞的增殖、诱导细胞凋亡以及延缓人乳腺癌SK-BR-3细胞向划痕中央聚集。结论 山慈菇含药血清能够有效抑制人乳腺癌SK-BR-3细胞活性，并加速细胞凋亡以及延缓细胞的迁移能力。
　　关键词：山慈菇含药血清;人乳腺癌SK-BR-3细胞;细胞凋亡;细胞迁移
　　【Abstract】Objective：To observe the effects of Iphigenia indica Kunth drug serum on the proliferation，apoptosis and migration ability of human breast SK-BR-3 cells. Methods：20 SD female rats of 2 months old and weighing （200 ± 20）g were randomly divided into an experimental group and a blank control group by using a random number table method，10 rats per group. The rats in the experimental group were administered with Iphigenia indica Kunth decoction and the rats in the control group were given the same volume of physiological saline once a day for 6 days. In the last time，the abdominal aorta was taken for blood to make drug serum. At the same time human breast cancer SK-BR-3 cells were bred. MTT method was used to detect the proliferation of the human breast cancer SK-BR-3 cells. SK-BR-3 apoptosis was observed by using a fluorescence microscope，and SK-BR-3 cell migration was detected by a scratch test. Results：Compared with the control group，the experimental group can significantly inhibit the proliferation of the human breast cancer SK-BR-3 cells，induce cell apoptosis and delay the accumulation of the human breast cancer SK-BR-3 cells toward the center of the scratch. Conclusion：Iphigenia indica Kunth drug serum can effectively inhibit human breast cancer SK-BR-3 cell activity，accelerate cell apoptosis and delay cell migration.
　　【Key words】Iphigenia indica Kunth drug serum，human breast cancer SK-BR-3 cells，cell apoptosis，cell migration
　　 乳腺癌是常見的女性疾病之一，近年来其发病率呈逐年上升趋势。随着医学技术的发展，手术、化疗及放疗等治疗手段不断提高，虽然总体5年内的生存率得到明显提升，但是死亡人数依然居高不下，严重威胁着女性的健康安全[1]。同时靶向药物虽然能够延长患者的生存时间，但是整体治疗效果不能够达到预期，并且其毒副作用往往降低患者的生存质量[2]。现代中药药理研究发现山慈菇中药能够明显抑制肿瘤细胞的增殖、分裂，降低肿瘤的复发率和转移，并且毒副作用小，能够更好的改善患者的生存质量[3]。
　　山慈菇始载于《本草拾遗》，性甘、凉、微辛，具有清热解毒、消痈散结之功，在肿瘤的治疗领域应用广泛，能够通过干预肿瘤细胞的增殖、分裂、迁徙以及心血管的生成，从而达到治疗肿瘤的作用[4]。本实验通过观察山慈菇含药血清对乳腺癌SK-BR-3肿瘤细胞的影响作用，探讨其干预乳腺癌细胞增殖、凋亡以及迁移能力的作用机制。
　　1 实验材料
　　1.1 实验药物及动物的制备 选用20只SD雌性大鼠，2月龄，体重（200±20）g，使用随机数字表法将大鼠随机分为实验组和空白对照组，每组10只。
　　细胞培养：人乳腺癌SK-BR-3细胞为贴壁生长，将细胞放置于含有10%特级牛血清、1%青链霉素双抗的DMEM细胞培养液中，SK-BR-3细胞繁殖到80%融合时，使用消化液将贴壁生长的细胞进行传代。随机选择对数期的SK-BR-3细胞放在CO2培育箱中，每隔24h进行换液传代[5]。 　　药物制备：100 g山慈菇第1次加入8倍量的水煎煮30 min，第2次加入4倍量的水煎煮20 min，合并滤液，进行过滤，然后将滤液浓缩至1.21 g生药/mL。
　　2 实验方法
　　2.1 实验动物给药 根据成人每日临床剂量30 g，按大鼠等效剂量相当于人的6.3倍计算，且大鼠胃容量为0.875mL/100 g[6]。山慈菇组大鼠给药剂量为：山慈菇浓煎剂0.01 mL·（g·d）;对照组大鼠给予等体积的生理盐水，每日灌胃1次，连续6d。
　　2.2 实验取材 取材当天，禁食水，在大鼠末次给药2h后，以0.015mL/g剂量的水合氯醛进行腹腔注射，麻醉大鼠，用无抗凝剂的真空采血管从大鼠腹主动脉取血，静置2 h，3000 r/min 离心10 min，取上层血清，置于56℃水浴中灭活30 min，最后，使用过滤器滤过血清进行除菌，-20℃保存备用。
　　2.3 实验检测方法
　　2.3.1 MTT法检测人乳腺癌細胞SK-BR-3细胞生长增殖情况 将人乳腺癌SK-BR-3细胞以1乘10*5/mL接种于96孔板上，每孔100 uL置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，吸除原培养液，实验组予以药物干预，全部置于培养箱中48 h，用4℃生理盐水洗2次，加0.5 mg /mL MTT溶液100 μL，避光，孵育4 h，加入150 μL DMSO，继续避光，并摇床摇匀15 min后上机检测，分析乳腺癌SK-BR-3细胞抑制率[7]。
　　2.3.2 荧光显微镜观察山慈菇含药血清作用前后对SK-BR-3凋亡情况的影响 取对数生长期人乳腺癌SK-BR-3细胞，以1乘10*5/mL密度接种于6孔板中，每孔2 mL，待细胞贴壁24 h后吸出原培养液，每孔加入2 mL质量浓度不同的含药血清作为实验组，每组设立两个复孔;同时以加入等量培养基的乳腺癌 SK-BR-3细胞作为对照组。放置于CO2培养箱内培养48h，吸除原培养液，加入预冷的磷酸盐缓冲溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）洗2遍，再加入4%甲醛固定20 min，继续以PBS洗涤2 min，待其晾干，加入0.1%TritonX-100处理3次（每次10 min），间隔PBS洗涤10 min，再将生理盐水配成的0.05 mg /mLDAPI染液进行染色，常温下避光20 min，吸出染料后PBS洗涤2次。最后，在荧光显微镜下观察SK-BR-3细胞的细胞核的形态[8]。
　　2.3.3 划痕试验检测乳腺癌SK-BR-3细胞迁移情况 将对数生长期的乳腺癌SK-BR-3细胞接种于每孔2 mL的6孔板中，细胞密度为5×10*4/mL，培养24h，用200 μL无菌枪头依次在每个孔底划“十”字划痕，生理盐水洗2遍，拍照记录后分别加入含药血清作为实验组，并设立对照组，继续培养24 h。最后，于显微镜下观察划痕愈合度，拍照记录分析细胞的迁移情况[9]。
　　3 实验结果
　　3.1 MTT法检测人乳腺癌SK-BR-3细胞生长增殖情况结果 不同浓度的山慈菇含药血清（0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）处理人乳腺癌细胞SK-BR-3细胞48h，SK-BR-3细胞的生长增殖情况分别为（0.860±0.063）%、（0.747±0.064）%、（0.484±0.039）%、（0.149±0.055）%、（0.128±0.029）%、（0.111±0.008）%、（0.104±0.019）%、（0.101±0.023）%、（0.100±0.019）%（见图1）。与对照组比较，山慈菇含药血清浓度在10%时，对SK-BR-3细胞增殖无明显的抑制作用（P>0.05），当浓度达到20%时，能够明显的抑制对SK-BR-3细胞的增殖（P<0.05），随着浓度的增加，对SK-BR-3细胞的增殖作用约强。
　　3.2 荧光显微镜观察山慈菇含药血清作用前后SK-BR-3凋亡情况结果 由荧光结果可知（图2），对照组图片表现为均匀的淡蓝色荧光反应，实验组荧光图片为山慈菇含药血清诱导后的SK-BR-3细胞，呈现出典型的细胞凋亡特征，如核碎裂、核染色质浓缩聚集以及蓝白色荧光等。因此实验组SK-BR-3凋亡情况较对照组明显，所以山慈菇含药血清能够明显诱导SK-BR-3细胞凋亡。
　　3.3 划痕试验检测乳腺癌SK-BR-3细胞迁移情况结果 划痕试验检测乳腺癌SK-BR-3细胞迁移情况结果显示：对照组SK-BR-3细胞24h后向划痕中间聚集，而山慈菇含药血清图片中有明显更少的SK-BR-3细胞向中央聚集。由此可知，山慈菇含药血清能够明显的抑制乳腺癌SK-BR-3细胞的迁徙能力。
　　4 讨论
　　乳腺癌是一种风险极高的癌症，可能通过转移和复发危及患者的生命安全，并且发病率呈逐年上升趋势，所以乳腺癌的发病机制越来越受到医学界的关注。
　　乳腺癌属于中医学中“乳岩”范畴，多为本虚标实之证，阳气不足，冲任失调，抑制痰饮、瘀血等实邪，互结于乳络，治当以活血化痰散结之法[9]。现代医学认为乳腺细胞的异常增殖和凋亡可能是导致乳腺癌发病的重要机制之一，如何调控乳腺细胞的异常增殖和凋亡是解决乳腺癌的关键。细胞凋亡是在细胞基因的调控下，引起细胞自主凋亡的过程[10]。
　　目前的治疗手段依旧以手术和放疗、化疗为主，其创伤性和化疗药物带来的副作用巨大。由于患者对肿瘤的认识不足，当发现乳腺癌时，往往为疾病的晚期，通常会错过本病的最佳治疗时间，在临床治疗中常加大化疗药物的剂量，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的，但由于药物剂量的增大，毒副作用亦明显，而且长期使用使肿瘤细胞产生耐药性，后期治疗效果不佳。因此患者希望寻求一种温和的治疗方式，提高生命质量，探索新的治疗药物也能成为医学界的最关注的热点。山慈菇化痰散结，常用于乳岩的治疗，而现代药理亦表明山慈菇具有抗肿瘤、抗血管活性等作用，特别是在抗肿瘤中的作用受到重视，认为山慈菇能够通过抑制乳腺肿瘤细胞的增殖、诱导其凋亡、延缓其迁移能力，从而达到治疗乳腺癌的作用[11]。 　　相关细胞实验表明，药物抗肿瘤的作用机制主要为抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡以及逆转肿瘤细胞行为等方面[12]。本实验结果显示，山慈菇含药血清干预乳腺癌细胞后，能够明显抑制乳腺癌SK-BR-3细胞的活性，抑制肿瘤细胞的生长，并且在药物浓度为20%时作用显著，随着浓度的增加，其抑制作用越强，表现为浓度依赖性。在荧光实验中实验组中SK-BR-3细胞经山慈菇含药血清诱导，出现明显的细胞凋亡;在划痕实验中，实验组肿瘤细胞和对照组比较，向中央迁移明显较少，表明山慈菇含药血清能够明显延缓肿瘤细胞的遷徙，从而逆转其行为。综上所述，山慈菇含药血清可能通过抑制肿瘤SK-BR-3细胞的增殖、诱导SK-BR-3细胞的凋亡以及延缓SK-BR-3的迁移，从而达到治疗乳腺癌的目的，但是其具体的分子机制仍未明确，需要进一步的实验证明。
　　参考文献：
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