自拟蠲痹补肾方含药血清对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖与凋亡的研究

来源:用户上传      作者:解骏 李少华 凌芸

　　摘要：目的 探讨不同浓度自拟蠲痹补肾方对类风湿关节滑膜炎症的影响机制，为临床应用提供实验依据。方法 Wistar大鼠32只随机分为4组：空白对照组（灭菌用水灌胃）、自拟蠲痹补肾方高浓度组、自拟蠲痹补肾方低浓度组，雷公藤多苷片组。通过研究高低二个不同剂量的自拟蠲痹补肾方对类风湿关节炎的患者滑膜成纤维细胞的影响，探讨其可能的作用机制。结果 与空白对照血清相比，自拟蠲痹补肾方含药血清均能显著抑制滑膜成纤维细胞PCNA mRNA、Bcl-2 mRNA表达（P<0.0001）。结论 自拟蠲痹补肾方可能是通过调节滑膜成纖维细胞PCNA mRNA、Bcl-2 mRNA表达，抑制滑膜成纤维细胞增殖而发挥作用。
　　关键词：类风湿关节炎;滑膜炎症;成纤维细胞
　　中图分类号：R593.22   文献标志码：A   文章编号：1007-2349（2020）02-0068-04
　　
　　类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA），在世界范围内的发病率在1～3%左右，以慢性起病，最终累及全身多个系统的自身免疫性的病患，在我国，大约有四五百万人受RA 的困扰，报道的致残率可高达50%[1-2]。RA在起病的最初2-3年内会发生不可逆的关节周围的骨丢失，进而致关节毁损和全身性骨质疏松症的发生。RA的临床表现为慢性、进行性及对称性四肢多关节的炎症，随着疾病的发展，会引起全身多个系统的损伤。RA关节内的病理特征表现是慢性增生性炎症和血管翳的形成，并破坏软骨面、软骨下骨的骨质，以及关节周围的软组织等，因此会造成关节内结构的毁损，最终的临床转归是关节功能丧失、外观畸形以及关节局部和全身性骨量的丢失。目前公认RA的这些病理变化均与滑膜成纤维细胞的凋亡不足密切相关，而细胞凋亡不足是大多数的肿瘤和自身免疫系统疾病的一个重要病因[3]，因此，如果加速滑膜成纤维细胞的凋亡可以有效治疗RA[4]。本次实验选用我院自拟蠲痹补肾方作为研究对象，此方具有活血散瘀、消肿止痛、补肾强骨的功效，在本院临床使用多年，得到了广大医生和患者的认可。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 实验动物与滑膜组织 SPF级的雌性Wistar大鼠32只，体重为（200±10）g，购自中国科学院上海实验动物中心，动物生产许可证号为SCXK（沪）2007 0005，动物使用许可证号为SYXK（沪）2008 0050。所有的患者的滑膜组织均来自上海中医药大学附属光华医院关节外科。所有的病例均为女性患者，年龄（53.27±6.11）岁，病程（8±13.85）a，诊断均符合1987年美国风湿病学会诊断标准。
　　1.1.2 主要药物 自拟蠲痹补肾方（方剂主要为骨碎补、白芍、仙灵脾、豨莶草、补骨脂、青风藤、黄芪、络石藤）。雷公藤多苷片，规格：10mg/粒，购自黄石飞云制药有限公司，生产批号：20110301。
　　1.2 方法
　　1.2.1 含药血清的制备 32只大鼠随机分为对照（灭菌用水）组、自拟蠲痹补肾方高浓度组、自拟蠲痹补肾方低浓度组，雷公藤多苷片组。灭菌用水组：灭菌用水3mL/只/天，分2次灌胃。自拟蠲痹补肾方组：主要以美国FDA提出的临床等效剂量换算公式，以人的使用剂量为标准，得出大鼠的剂量，每只大鼠每天3mL，分两次灌胃;雷公藤多苷片组3mL灌胃。连续用药3天后，在第3天给药后1 小时采血。选择灭菌非抗凝剂的试管中，注射入所采的大鼠血液，室温等待血液凝结。将所首先在37℃水温浴1 小时，离心15分钟（转速：3000 转/分钟）分离血清，-20℃冰箱冻存备用。在使用前，先用56℃恒温箱内30分钟灭活，然后使用不带血清的培养基稀释，过滤后清除细菌。
　　1.2.2 原代滑膜细胞的分离培养与传代 无菌条件下把滑膜组织置于盛有5%FBS DMEM 的15mL离心管中，并于2小时内置入盛有DMEM培养液的无菌培养皿，清除滑膜组织表面的脂肪组织及血凝块，清洗3次。将滑膜组织剪碎至1 mm3的小块置于6 cm2培养皿中，加入4mL DMEM培养液，再加500 μL的Ⅰ型胶原酶（终浓度为3 mg/mL），再次放入37℃ 5%CO2 培养箱内消化4小时后，见絮状样的关节滑膜组织。用100目的滤网过滤，加PBS冲洗，滤液离心5分钟（1500转/分），去除上清液。打散细胞，加入15% FBS DMEM，置10 cm2培养皿中，37℃ 5%CO2 培养箱，待细胞密集度大于80%后，消化传代培养，当传至第三代后，予以胰酶消化待用。
　　1.2.3 含药血清对体外滑膜成纤维细胞增殖作用的影响 将浓度为2×103个/mL的第3代成骨细胞，以100 μL/孔种于96孔培养板，用2%胎牛血清培养液饥饿培养24 h后，分为4组：（1）20%空白血清组;（2）20%自拟蠲痹补肾方高浓度含药血清组;（3）20%自拟蠲痹补肾方低浓度含药血清组;（4）20%雷公藤多苷片含药血清组。每组8孔，置于37℃ 5%CO2培养箱中，培养24 h，弃100μl培养液后，每孔加入20μl的噻唑基四唑（MTT）溶液（5 mg/mL），37℃孵育4 h;弃上清，每孔加150μl二甲基亚砜（DMSO）溶解结晶，置酶联免疫检测仪上测定吸光值（波长490nm）。计算方法：细胞存活率%=（OD试验孔/OD对照孔）×100%。
　　1.2.4 含药血清对体外滑膜成纤维细胞的PCNA mRNA、Bcl-2 mRNA表达的影响 （1）取第3代成骨细胞，予以0.25%胰蛋白酶消化后，反复吹吸成为单细胞悬液;细胞浓度调整为2×104个/mL，接种于12孔细胞培养板中，每孔1 mL，37℃ 5%CO2培养箱内培养24 h;吸净孔板里的培养液，更换为l%胎牛血清培养液饥饿12 h;吸净孔板里的培养液，再次更换为20%空白对照血清、20%自拟蠲痹补肾方高浓度含药血清、20%自拟蠲痹补肾方低浓度含药血清、20%雷公藤多苷片含药血清组，每组3孔，再次予以培养24 h;（2）按Trizol法试剂说明书提取滑膜成纤维细胞RNA，取1μg总RNA为模板，逆转录成cDNA;（3）引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1;（4）实时定量PCR：将荧光染料SYBR Green和目的基因Bcl-2以及内参Actin的引物按5μl SYBR Green+0.15μl引物混匀，封膜后，放入实时PCR仪（ABI 7900）进行PCR反应，测定出PCNA mRNA表达;Bcl-2基因表达的CT值，根据公式2-△CT计算基因的相对表达量。 　　1.2.5 统计学处理 采用SPSS（24.0版本）软件对实验数据进行统计学分析，数据符合正态分布要求，按照均数±标准差表示，如果各治疗组方差齐，采用LSD-t检验进行组间的两两比较;单独2组样本均数比较时，若方差齐，采用t检验，如果方差不齐，改用t′检验，P<0.05时有统计学意义。
　　2 结 果
　　2.1 自拟蠲痹补肾方的含药血清对于滑膜成纤维细胞的作用 如表2所示，与空白对照组比较，当作用时间在48小时，5%、10%的自拟蠲痹补肾方含药血清对滑膜成纤维细胞增殖均无差别;且不同浓度自拟蠲痹补肾方含药血清对滑膜成纤维细胞增殖也未见差别;20%含药血清作用时，高浓度的自拟蠲痹补肾方含药血清可显著抑制滑膜成纤维细胞增殖（P<0.001）。而表3所示，当对比空白对照组，在20%含药血清作用时，高、低浓度自拟蠲痹补肾方及雷公藤多苷片含药血清均能显著抑制滑膜成纤维细胞增殖（P<0.0001），但三组之间比较均无统计学意义。
　　2.2 含药血清对体外培养滑膜成纤维细胞 PCNA mRNA表达的影响 如表4所示，对比空白对照组，使用20%含药血清干预时，高、低浓度自拟蠲痹补肾方及雷公藤多苷片含药血清均显示对于抑制滑膜成纤维细胞PCNA mRNA表达有显著意义（P<0.0001），但高浓度的自拟蠲痹补肾方比低浓度更具有显著意义（P=0.037<0.05）。
　　2.3 含药血清对体外培养滑膜成纤维细胞 Bcl-2 mRNA表达的影响 与如表5所示，与空白对照血清相比，高、低浓度自拟蠲痹补肾方及雷公藤多苷片含药血清均显示对于抑制滑膜成纤维细胞Bcl-2 mRNA表达有显著意义（P<0.0001），三组间均没有统计学意义。
　　3 结论
　　自拟蠲痹补肾方可能通过调节PCNA与Bcl-2基因的表达，从而抑制滑膜成纤维细胞增殖，达到抑制炎症与减少骨丢失的目的。
　　4 讨论
　　文献报道，在类风湿关节炎病变的关节内可见滑膜明显增生，而这些滑膜对关节内炎症及关节破坏过程中起着重要意义[5-7]。原因在于滑膜成纤维细胞可能会分泌各种细胞因子等产物，如蛋白酶类、花生四烯酸代谢产物等等，最终这些炎症因子引起了RA的临床病理变化。因此，滑膜成纤维细胞的过度增殖导致的滑膜增生是RA重要的病理特征之一[8-9]。
　　目前认为滑膜细胞凋亡不足，炎性滑膜细胞数目成倍数的增生，是RA的重要变化。一般正常情况下，人体可以通过增加细胞凋亡，从而清除这些过多的细胞而保持动态平衡。但加入滑膜细胞凋亡不足，就会可导致滑膜组织增生并进而出现关节破坏的一系列病理改變，因此RA发病的主要机制就是滑膜成纤维细胞增生过多和凋亡不足。因此目前认为治疗RA的重要途径之一，就是抑制滑膜成纤维细胞增殖、诱导增加其凋亡[10-11]。而传统的植物提取物中，雷公藤红素[12]、姜黄素等[13]据报道可以诱导DNA损伤、细胞周期阻滞以及凋亡作用，因此其可以抑制滑膜成纤维细胞增殖，是治疗RA重要药物;但由于具有高毒性以及效果不明确的缺点限制了其使用。而中药有效成分治疗RA具有多靶点、多种途径的特点，药理活性比较广泛，被认为有重要的研究价值;而化学合成药及激酶抑制剂类等药物已经通过相关的临床研究明确了在治疗RA中的治疗效果和相对可靠的安全性，但是其长期用药的安全性仍有待观察[14]。
　　类风湿关节炎（RA）属于中医“痹症”“历节”范畴。古代医家一般认为风寒湿邪外侵是重要的外因。临床上RA的发病多为内外因相互共同作用的结果。随着当代医学的持续进步，运用现代医学的研究结果，阐明了类风湿关节炎的可能发病机理。现代医家经过继承发展，认为RA的性质为本虚标实，肝肾脾虚为本，湿滞、瘀阻为标。本方扶正逐邪，标本兼顾、活血散瘀、消肿止痛，正切中RA本虚标实，肝肾脾虚为本，湿滞、瘀阻为标的病机，是治疗痹症的较好的方剂。
　　本次实验主要分析了本院通用的自拟蠲痹补肾方的含药血清对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖的影响。此次我们的实验表明：高、低浓度的自拟蠲痹补肾方含药血清均能显著抑制滑膜成纤维细胞PCNA mRNA表达，且高浓度的自拟蠲痹补肾方比低浓度更显著。
　　目前比较公认的具有调控细胞凋亡的基因家族之一就是Bcl-2基因家族及其相关蛋白Bcl-2，而目前研究表明它与细胞凋亡可能有关的基因之一。Bcl-2是重要的细胞凋亡调节基因，其通过抑制多种形式的细胞死亡，从而延长了细胞寿命，增加了细胞数目，并且增加遗传物质的突变率。高、低浓度的自拟蠲痹补肾方含药血清均能显著抑制滑膜成纤维细胞Bcl-2 mRNA表达。
　　本次采用中药血清药理学研究方法，通过观察自拟蠲痹补肾方含药血清对体外培养滑膜成纤维细胞增殖及凋亡的影响，我们研究结果显示20%自拟蠲痹补肾方含药血清的对于滑膜成纤维细胞，具有抑制增殖及促进凋亡的作用，而且实验结表明高浓度的自拟蠲痹补肾方比低浓度的效果更明确。经定量PCR检验进一步证实：自拟蠲痹补肾方的含药血清使PCNA与Bcl-2表达显著下降，表明它能显著抑制滑膜成纤维细胞增殖，显示了与MTT实验的结果的一致性，这可能是自拟蠲痹补肾方含药血清能够下调滑膜成纤维细胞增殖可能的作用机制之一。该研究在细胞水平及分子水平上为自拟蠲痹补肾方用于临床RA治疗提供了有力的实验依据，在开发治疗RA的新型中药复方中，可考虑多种药物联合应用，从细胞分子水平、基因角度以及治疗靶点入手，找出抗RA的高效治疗药物。
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　　（收稿日期：2019-10-18）
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