脐带间充质干细胞对CTX导致的药物性肝损伤大鼠的治疗作用

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　　【摘要】 目的 分析臍带间充质干细胞（UC-MSC）对环磷酰胺（CTX）导致的药物性肝损伤大鼠的治疗作用。方法 以87只健康成年SPF级雄性SD大鼠为研究对象， 根据随机数字表法分成溶剂对照组、CTX给药组、CTX联合UC-MSC治疗组， 各29只。CTX联合UC-MSC治疗组第1、4、7及10天均予以UC-MSC进行尾静脉注射， 第3天给予CTX腹腔注射;CTX给药组第3天施以CTX腹腔注射;溶剂对照组按照以上两组同样时间、同样方式给予生理盐水。对比三组体重、肝脏/体质量、血清肝功能生化指标[天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、血清总胆红素（TBIL）、血清碱性磷酸酶（ALP）]、氧化应激[超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽（GSH）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、过氧化脂质（LPO）]损伤状况。结果 CTX给药组、CTX联合UC-MSC治疗组体重分别为（234.52±15.18）、（253.41±15.36）g低于溶剂对照组的（286.75±20.79）g， 且CTX给药组体重低于CTX联合UC-MSC治疗组;CTX给药组、CTX联合UC-MSC治疗组肝脏/体质量分别为（0.05±0.01）、（0.04±0.01）高于对照组的（0.03±0.01）， 且CTX给药组高于CTX联合UC-MSC治疗组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。CTX给药组、CTX联合UC-MSC治疗组AST、ALT、TBIL、ALP水平分别为（180.46±20.78）U/L、（102.43±23.49）U/L、（2.31±0.38）μmol/L、（167.46±20.78）U/L及（162.35±20.46）U/L、（82.67±20.16）U/L、（0.87±0.02）μmol/L、（158.15±20.57）U/L均高于溶剂对照组的（98.76±12.49）U/L、（36.85±4.57）U/L、（0.14±0.01）μmol/L、（105.82±25.13）U/L， 且CTX给药组高于CTX联合UC-MSC治疗组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。CTX给药组、CTX联合UC-MSC治疗组SOD、GSH-Px、GSH低于溶剂对照组， 且CTX给药组低于CTX联合UC-MSC治疗组， 差异具有统计学意义 （P<0.05） ;CTX给药组、CTX联合UC-MSC治疗组NO、MDA、LPO高于溶剂对照组， 且CTX给药组高于CTX联合UC-MSC治疗组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 UC-MSC能有效减轻CTX所致的大鼠药物性肝损伤， 值得临床应用。
　　【关键词】 环磷酰胺;脐带间充质干细胞;药物性肝损伤
　　DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.30.002
　　The therapeutic effect of umbilical cord mesenchymal stem cells on CTX-induced liver injury in rats   WANG Jia. Jiangsu Zhengda Fenghai Pharmaceutical Co.， Ltd， Nanjing 210046， China
　　【Abstract】 Objective   To analyze the role of umbilical cord mesenchymal stem cells （UC-MSC） on cyclophosphamide （CTX）-induced liver injury in rats. Methods   A total of 87 healthy adult SPF male SD rats as study subjects were divided into solvent control group， CTX group， and CTX combined with UC-MSC group according to random numerical table， with 29 rats in each group. In CTX combined with UC-MSC group， UC-MSC was injected via caudal vein on 1st， 4th， 7th and 10th day， and CTX was intraperitoneally injected on 3rd day; CTX group was given intraperitoneal injection of CTX on 3rd day; the solvent control group was given normal saline at the same time and in the same manner. The body weight， liver/body mass， serum liver function biochemical indicators [aspartate aminotransferase （AST）， alanine aminotransferase （ALT）， serum total bilirubin （TBIL）， serum alkaline phosphatase （ALP）]， oxidative response kinase [superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， glutathione （GSH）， nitric oxide （NO）， malondioxide aldehyde （MDA）， lipid peroxide （LPO）] of the three groups were compared. Results   The weight of CTX group and CTX combined with UC-MSC group were （234.52±15.18） and （253.41±15.36） g were lower than （286.75±20.79） g of the solvent control group， CTX group was lower than CTX combined with UC-MSC group; the liver/body mass of CTX group and CTX combined with UC-MSC group were （0.05±0.01） and （0.04±0.01）， which were higher than （0.03±0.01） of the solvent control group， and CTX group was higher than CTX combined with UC-MSC group. The difference was statistically significant （P<0.05）. The levels of AST， ALT， TBIL and ALP of CTX group and CTX combined with UC-MSC group were （180.46±20.78） U/L， （102.43±23.49） U/L， （2.31±0.38） μmol/L， （167.46±20.78） U/L and （162.35±20.46） U/L， （82.67±20.16） U/L， （0.87±0.02） μmol/L， （158.15±20.57） U/L， which were higher than （98.76±12.49） U/L， （36.85±4.57） U/L， （0.14±0.01） μmol/L， （105.82±25.13） U/L of solvent control group， and CTX group was higher than CTX combined with UC-MSC group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. SOD， GSH-Px and GSH of CTX group and CTX combined with UC-MSC group were lower than those of solvent control group， and CTX group was lower than CTX combined with UC-MSC group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. NO， MDA， LPO of CTX group and CTX combined with UC-MSC group were higher than those of solvent control group， and CTX group was higher than CTX combined with UC-MSC group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion   UC-MSC can effectively reduce the drug-induced liver injury in rats caused by CTX and is worthy of clinical application. 　　【Key words】 Cyclophosphamide; Umbilical cord mesenchymal stem cells; Drug-induced liver injury
　　CTX属于广谱抗肿瘤药物， 在多种恶性肿瘤中均可发挥良好作用[1]。但在CTX使用过程中， 可出现一系列不良反应， 特别是肝毒性， 造成其应用范围受到一定影响[2]。CTX代谢在肝脏内进行， 通过肝脏微粒体混合功能氧化酶系的作用， 分解为4-羧基环磷酸胺， 在31-51-核酸内切酶作用下转化为丙烯醛与磷酰胺氮芥， 前者为引发不良反应的重要成分， 后者则为抗肿瘤活性成分[3]。丙烯醛属活动性不饱和醛， 能诱发脂质过氧化反应， 造成细胞损伤。现阶段， 临床上主要利用保肝药治疗CTX所致药物性肝损伤， 该种疗法虽能在一定程度上缓解患者肝功能损伤， 但不可改善其预后[4]。现有研究表示[5-7]， UC-MSC在失代偿期与终末期肝硬化、酒精性肝损伤治疗中均可发挥积极作用。鉴于此， 为明确在CTX所致药物性肝损伤治疗中UC-MSC的作用， 现对87只健康成年SPF级雄性SD大鼠展开研讨， 具体报告如下。
　　1 材料与方法
　　1. 1 材料 CTX（通化茂祥制药有限公司）、苏木染色液（厦门迈威生物科技有限公司）、戊巴比妥钠（山西云鹏制药有限公司）、柠檬酸缓冲液（北京百奥莱博科技有限公司）、反转录试剂盒（上海康朗生物科技有限公司）、谷胱甘肽过氧化物（海恒远生物科技有限公司）、TRIZOL试剂（北京华夏远洋生物科技中心）、总超氧物歧化酶（深圳思美泉生物医药要有限公司）、一氧化氮（常州凌肯自动化科技有限公司）、脂质过氧化物（上海亨代劳商贸有限公司）、丙二醇（山东富商化工有限公司）。87只健康成年SPF级雄性SD大鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司）， 按照随机数字表法分为溶剂对照组、CTX给药组、CTX联合UC-MSC治疗组， 各29只。
　　1. 2 方法
　　1. 2. 1 分组处理 在SPF级条件下饲养SD大鼠， 合理调整湿度、温度， 予以充足食物与水。待大鼠熟悉环境1周后开展实验。以下实验流程均重复3次：CTX联合UC-MSC治疗组大鼠首次注射UC-MSC作为实验第1天， 在第1、4、7及10天分别予以0.4 ml浓度为5×106/ml的UC-MSC实施尾静脉注射， 第3天给予200 mg/kg CTX进行腹腔注射;CTX组第3天给予CTX， 方法与CTX联合UC-MSC治疗组一致;溶剂对照组和以上两组相同时间、相同方式进行生理盐水注射。实验期间， 密切观察大鼠毛色、饮食、体重变化等， 分别于第4、7、10及13天从以上三组中选取7只大鼠， 腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠， 收集心脏血， 将肝脏取出， 测量其湿重， 计算器官与体重之比， 将部分肝脏组织浸泡于4%多聚甲醛内实施固定， 其余组织用液氮速冻后放于-80℃条件下备用。
　　1. 2. 2 UC-MSC分离-培养-鉴定 在无菌条件下提取脐血， 以密度梯度法分离获取单个核细胞， 按照5×106/cm2在T25培养瓶中实施接种， 每瓶内加入
　　10 ml含有10% 血清（FBS）的DMEM/F12培养基液， 并于5%CO2、37℃饱和湿度培养箱内培养。5 d后进行换液， 后期每隔3 d换液1次。当细胞融合>80%时， 以0.05%胰酶消化并进行传代。选择第3代细胞， 用小鼠单克隆抗体CD105-FITC、CD34-PE标记细胞， 并用流式细胞仪实施检测。
　　1. 2. 3 CTX损伤判断及UC-MSC治疗效果验证 ①氧化应激损伤相关指标测定：于预冷生理盐水内漂洗肝脏组织， 以滤纸擦拭， 取0.1 g放于EP管内， 加入0.9 ml
　　生理盐水， 以超声波破碎细胞法将其制成10%组织匀浆， 频率控制为10 s/次， 间隔时间控制为10 s， 反复
　　5次。离心后， 提取上层清液， 根据试剂盒说明书采用硝酸还原酶法、分光光度法测定浆液内GSH、SOD、GSH-Px、LPO含量。②外周血肝脏生化指标检测：将心脏血以3500 r/min的速度离心20 min， 收集上层清液， 以全自动生化分析仪测定TBIL、ALP、AST、ALT。
　　1. 3 观察指标 对比三组体重、肝脏/体质量、血清肝功能生化指标（AST、ALT、TBIL、ALP）、氧化应激（SOD、GSH-Px、GSH、NO、MDA、LPO）损伤状况。
　　1. 4 统计学方法 以Graphpad Prism 6作为数据制图工具， 采用SPSS24.0统计学软件进行统计分析。计量資料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用F检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
　　2 结果
　　2. 1 三组体重、肝脏/体质量对比 CTX给药组、CTX联合UC-MSC治疗组体重分别为（234.52±15.18）、（253.41±15.36）g低于溶剂对照组的（286.75±20.79）g，
　　且CTX给药组体重低于CTX联合UC-MSC治疗组;CTX给药组、CTX联合UC-MSC治疗组肝脏/体质量分别为（0.05±0.01）、（0.04±0.01）高于对照组的（0.03±
　　0.01）， 且CTX给药组高于CTX联合UC-MSC治疗组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。
　　2. 2 三组血清肝功能生化指标对比 CTX给药组、CTX联合UC-MSC治疗组AST、ALT、TBIL、ALP水平分别为（180.46±20.78）U/L、（102.43±23.49）U/L、（2.31±0.38）μmol/L、（167.46±20.78）U/L及（162.35±20.46）U/L、（82.67±20.16）U/L、（0.87±0.02）μmol/L、（158.15±20.57）U/L均高于溶剂对照组的（98.76±12.49）U/L、（36.85±4.57）U/L、（0.14±0.01）μmol/L、（105.82± 　　25.13）U/L， 且CTX给药组高于CTX联合UC-MSC治疗组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。
　　2. 3 三组氧化应激酶损伤状况对比 CTX给药组、CTX联合UC-MSC治疗组SOD、GSH-Px、GSH低于溶剂对照组， 且CTX给药组低于CTX联合UC-MSC治疗组， 差异具有统计学意义 （P<0.05） ;CTX给药组、CTX联合UC-MSC治疗组NO、MDA、LPO高于溶剂对照组， 且CTX给药组高于CTX联合UC-MSC治疗组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表3。
　　3 讨论
　　间充质干细胞（MSC）在体外与体内环境中均具有分泌充足营养因子的能力， 包括肝细胞生长因子（HGF）、表皮生长因子、碱性成纤细胞生长因子、血管内皮生长因子（VEGF）等[8]。当外源性UC-MSC注入动物体内时， 可诱发损伤部位VEGF水平的增加， 其作用机理可能为MSC通过促使肝脏微环境的改变， 来协助局部肝脏前体细胞分化、增殖， 从而改善损伤组织灌注与微循环， 为损伤组织提供充足营养物质， 避免实质细胞凋亡;而良好的血供可帮助周边内皮细胞增殖， 促进营养因子分泌， 提高损伤组织修复速度[9]。体外研究显示[10]， MSC能下调白介素-6、肿瘤坏死因子、白介素-1β等促炎因子的表达， 分泌白介素-10、白介素-12等抑炎因子， 组建免疫耐受环境， 促使淋巴细胞凋亡。所以， 当MCS进入损伤组织后， 通过营养因子的分泌， 能有效改善微环境， 协助组织再生， 减轻炎症反应， 防控实质细胞凋亡与组织纤维化， 促使心血管产生。诸多研究均证实[11， 12]， MSC能有效减轻多种原因所致的肝损伤。
　　综合现有研究结论， 可将MSC移植干预受损肝脏的途径归纳为以下几点：①防控肝脏纤维化：阻止HSC增殖， 引导细胞外基质降解， 促使HSC凋亡。
　　②协助内源性细胞增殖及分化：协助肝细胞分化、增殖， 防控肝细胞凋亡， 改善内源性异常状况。③免疫调节：激活T细胞， 阻碍抗原提呈细胞增殖， 减少刺激T调节细胞、淋巴细胞的增殖。④转变为实质细胞：MSC于体外可转变为肝实质细胞， 且具有肝细胞的储备、合成、代谢功能。经以上途径作用下， 可有效缓解小鼠肝功能损伤， 促进其肝功能的修复。在本研究中， CTX给药组体重、肝脏/体质量、血清肝功能指标、氧化应激酶损伤均出现显著变化， 而CTX联合UC-MSC治疗组也出现同样变化， 但相较于CTX给药组， CTX联合UC-MSC治疗组变化幅度较低， 这说明UC-MSC能有效改善CTX造成的小鼠肝功能损伤状况。
　　综上所述， 在CTX所致药物性肝功能损伤治疗中， UC-MSC可发挥良好作用， 值得临床实践及应用。
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　　[收稿日期：2020-05-13]
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