人脐带间充质干细胞大鼠膝关节内注射安全性研究

来源:用户上传      作者:崔晓燕

　　摘 要 目的：观察人脐带间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells， hUC-MSCs）膝关节内注射对大鼠的毒性反应。方法：实验分为生理盐水对照组、有血清MSCs低剂量组和高剂量组、无血清MSCs低剂量组和高剂量组。观察大鼠一般生命体征和血液尿液指标；取主要脏器组织进行病理学检查。结果：注射MSCs后，MSCs组与生理盐水对照组相比，大鼠一般生命体征、血常规、T淋巴细胞亚群、血清细胞因子、尿常规，均无显著差异；主要脏器组织病理学无明显改变。一部分血液生化指标虽然在MSCs注射后有所波动，但仍在参考范围内或接近参考范围上限。结论：膝关节内注射hUC-MSCs对大鼠没有明显的毒性反应。
　　关键词 人脐带间充质干细胞 大鼠 膝关节注射
　　中图分类号：R965.3； Q813.11 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2020）13-0063-07
　　Safety study of intra-articular administration of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in rats
　　CUI Xiaoyan*
　　（Shanghai Baonian biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201615， China）
　　ABSTRACT Objective： To investigate the toxic reactions of intra-articular administration of human umbilical cordderived mesenchymal stem cells （hUC-MSCs） in rats. Methods： Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into a normal saline control group， a low-dose F-MSCs （MSCs cultured with fetal bovine serum） group， a high-dose F-MSCs group， a low-dose SF-MSCs （MSCs cultured with serum-free medium） group， and a high-dose SF-MSCs group. General vital signs， blood routine， blood biochemistry， subsets of T cells， serum cytokines， routine urine， pathology of vital organs and tissues were respectively determined. Results： There were no obvious differences between the MSCs group and the control group in all other indicators except some blood biochemistry indicators. Conclusion： There was no obvious toxic effect of intra-articular administration of hUC-MSCs on rats.
　　KEy WORDS human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells； rat； intra-articular administration
　　间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）是一类源自中胚层，可在体外诱导分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞等的多能干细胞[1]。人脐带来源MSCs（human umbilical cord-derived MSCs，hUC-MSCs）由于取材方便和增殖快等优点，越来越受到临床应用的重视[2]。目前ClinicalTrials.gov官网注册的hUC-MSCs治疗膝骨关节炎临床试验研究中，大多数试验处于Ⅰ/Ⅱ期安全性和有效性研究阶段；且已发表的MSCs治疗膝骨关节炎临床研究报道中[3-5]，大多数研究为Ⅰ/Ⅱ期安全性和有效性研究。因此，hUC-MSCs用于治疗膝关节疾病的安全性仍有待于探索。国家食品药品监督管理总局发布的《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》中指出“细胞培养过程中，应尽量避免使用动物或人来源的物质，比如应尽量避免血清的使用”，因此本研究中hUC-MSCs的培养，除原有有血清培养体系之外，又使用含血清替代物的无血清培养体系。我们将2种培养体系的hUC-MSCs通过膝关节注射到正常Sprague-Dawley （SD）大鼠，动态监测大鼠一般生命体征、血常规、血液生化指标、T淋巴细胞亚群、血清细胞因子、尿常规等指标的变化，主要脏器组织进行病理学检查。阐明膝关节内注射hUC-MSCs 对SD大鼠的毒性反应，从而为hUC-MSCs的临床应用奠定基础。
　　1 材料和方法
　　1.1 人脐带来源间充质干细胞
　　hUC-MSCs采用组织贴块法培养，分为两种不同培养体系培养：①含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，美国Gibco公司）的DMEM/F12培养基（Hyclone）的有血清培养体系，MSCs标记为F-MSCs；②含5%的血清替代物（Helios）的α-MEM培養基（Gibco）的无血清培养体系，MSCs标记为SF-MSCs。
　　1.2 实验动物
　　清洁级SD大鼠共80只，6周龄，雌雄各50%，购自上海西普尔-必凯动物有限公司，合格证号20130016011010。 　　1.3 方法
　　1.3.1 hUC-MSCs细胞形态和表型鉴定
　　采用流式仪（FACSCanto II，美国BD公司）检测细胞表型，流式抗体PE Anti-Human CD44、CD90、CD73、CD105，CD14、CD19、CD34、CD45和PerCP Anti-Human HLA-DR均购自美国BD公司。
　　1.3.2 hUC-MSCs分化潜能分析
　　成脂试剂盒和成软骨试剂盒（中国Cyagen公司）及成骨试剂盒（美国Gibco公司），分别用于鉴定第5代hUC-MSCs向脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞分化潜能。
　　1.3.3 动物实验
　　SD大鼠分为5组：生理盐水对照组、有血清MSCs低剂量组、有血清MSCs高剂量组、无血清MSCs低剂量组和无血清MSCs高剂量组。每组各16只，雌雄各50%。
　　MSCs组分别于第0和21天时膝关节内注射0.4 ml第5代hUC-MSCs，左右后肢关节腔各注射0.2 ml。低剂量组注射（1×106）/kg的hUC-MSCs，高剂量组注射（1×107）/kg的hUC-MSCs，生理盐水组于第0和21天时膝关节内注射0.4 ml生理盐水。
　　1.3.4 安全性评价
　　1）检测一般生命体征 首次MSCs注射前（D0）、首次MSCs注射后的第14（D14）和35天（D35），观察和记录一般生命体征，包括肛温、血压、心率及注射部位局部观察，用nt X检测肛温，Softron 2006A检测血压和心率。称量体重。
　　2）移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）评分 在D0、D14、D35分别对动物进行GVHD评分，5个参数，各参数总分2分。①体重：每周体重下降<10%记为0分；下降10%～25%记为1分；下降>25%记为2分。②活动度：无下降记为0分；轻度下降记为1分；重度下降记为2分。③皮肤溃疡：皮肤完整无脱毛记为0分；小片浅溃疡或脱毛脱毛记为1分；大片溃疡明显皮肤裸露记为2分。④姿势：无异常记为0分；轻度异常记为1分；姿势呈弓背样改变记为2分。⑤耸毛：无耸毛记为0分；轻度耸毛记为1分；重度耸毛记为2分。
　　3）血常规和生化指标检测 在D0、D14、D35分别于眼眶静脉丛采血，EDTA抗凝，检测和比较血常规；采用试剂盒（南京建成生物工程研究所）检测生化指标。
　　4）T淋巴细胞亚群免疫学指标 在D0、D14、D35分别于眼眶静脉丛采血，EDTA抗凝，分离单核细胞，使用CD3抗体（FITC Mouse Anti-Rat CD3，美国BD公司），CD4抗体（PE-Cy 5 Mouse Anti-Rat CD4）和CD8抗体（PE Mouse Anti-Rat CD8a）均购自美国eBioscience公司，4 ℃避光孵育1 h，用Accuri C6流式细胞仪（美国BD公司）检测T淋巴细胞亚群。
　　5）血清细胞因子检测 采用BD公司的CBA试剂盒检测血清γ-IFN、IL-2、IL-4、IL-10、TNF含量。
　　6）尿常规检测 在D0、D14、D35分别采集大鼠尿液，检测和比较尿常规。
　　7）病理学检查 在D14、D35分别处死并解剖8只大鼠/组，取心、肝、脾、肺、肾、脑和注射部位肌肉，甲醛固定，石蜡包埋，采用徕卡公司SQ2125石蜡切片机切片，HE染色。采用Nikon Eclipse Ni显微镜观察组织病理学有无改变。
　　1.3.5 统计学分析
　　2 结果
　　2.1 hUC-MSCs的鉴定
　　hUC-MSCs细胞形态均为梭形。
　　流式细胞仪检测第3代SF-MSCs特异性表面抗原CD44、CD90、CD73和CD105的阳性率分别为99.9%、100.0%、99.4%、98.1%，而CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR的表达为阴性。第3代F-MSCs特异性表面抗原CD44、CD90、CD73、和CD105的阳性率分别为100.0%、100.0%、99.5%、99.0%，而CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR的表达为阴性。
　　第3代F-MSCs和SF-MSCs在成脂、成软骨和成骨诱导条件下，形成大的脂滴、软骨球和钙结节。
　　2.2 一般生命体征
　　大鼠注射生理盐水和MSCs后全部存活。注射MSCs各组和注射生理盐水组相比，体重、肛温、收缩压、舒张压和心率全部无显著性差别（表1）。
　　2.3 GVHD评分
　　MSCs组和生理盐水对照组，GVHD评分均为0分。
　　2.4 血常规
　　注射MSCs后，血常规指标无显著改变（P > 0.05，表2）。
　　2.5 血液生化
　　D14测定的血液生化指标与生理盐水组相比，有血清低剂量组和有血清高剂量组的ALP（谷丙转氨酶）显著升高，有血清低剂量组、有血清高剂量组、无血清低剂量组和无血清高剂量组的ALB（白蛋白）和BUN（尿素氮）显著升高，无血清高剂量组的TC（总胆固醇）显著升高，有血清低剂量组、有血清高剂量组、无血清低剂量组和无血清高剂量组的GLU（葡糖糖）显著升高，其他血液生化指标无显著改变（P > 0.05，表3）。
　　与生理盐水组相比，D35有血清低劑量组和有血清高剂量组的ALT显著升高，有血清低剂量组、有血清高剂量组、无血清低剂量组和无血清高剂量组的AST（谷草转氨酶）、ALB和BUN显著升高，有血清高剂量组的TC显著升高，其他血液生化指标无显著改变（P > 0.05，表3）。
　　2.6 T淋巴細胞亚群指标
　　与生理盐水对照组相比，MSCs注射组CD3+、 CD4+、CD8+ T淋巴细胞百分数和CD4+/CD8+比值无显著改变（图1）。
　　2.7 血清细胞因子检测
　　血清IFN-γ和IL-2均未检测到，与生理盐水对照组相比较，MSCs组注射MSCs后TNF（肿瘤坏死因子）、IL-4、IL-10含量无显著改变（图2）。
　　2.8 尿常规
　　与生理盐水对照组相比较，MSCs注射组尿常规指标无显著改变（P > 0.05）。
　　2.9 病理学检测
　　病理学评价委托中国科学院上海药物研究所药物安全评价研究中心完成。经显微镜下诊断，有血清MSCs低剂量组、高剂量组和无血清MSCs低剂量组、高剂量组的7种组织脏器（心、肝、脾、肺、肾、脑、骨骼肌）均未见明显与MSCs相关的病理组织学改变。3 讨论
　　近年来MSCs干预膝骨关节炎的临床前研究和临床研究日益增多[6-10]，脐带由于取材方便和易于扩增等优点成为膝骨关节炎细胞治疗的重要原材料。本实验中2种培养体系的人脐带间充质干细胞的表面抗原表型和分化潜能均符合国际细胞治疗协会（International Society for Cellular Therapy， ISCT）制定的MSCs鉴定标准[11]，hUC-MSCs细胞纯度在95 %以上。
　　GVHD是异基因造血干细胞移植引起的一种危及生命的并发症[12]。本实验GVHD评分为0分，注射hUCMSCs没有引发大鼠GVHD。hUC-MSCs表达HLA-G，HLA-G具有很强的免疫抑制作用[13]。同时hUC-MSCs不表达HLA-II抗原，为低免疫原性细胞。
　　有血清低剂量组和有血清高剂量组的ALP、无血清MSCs高剂量组的TC、各实验组的GLU，虽然在D14显著升高，但在D35与生理盐水对照组相比无显著差异。
　　各实验组的ALB（D14和D35）、有血清低剂量组和有血清高剂量组的ALT（D35）、各实验组的AST（D35），虽然这三个生化指标在MSCs注射后有所升高，但是仍然在参考范围内：SD雄性大鼠ALB为3.9～4.9 g/dl，雌性大鼠ALB为4.0～5.2 g/dl；SD雄性大鼠ALT为25～55 IU/L，雌性大鼠ALT为25～50 IU/L；SD雄性大鼠AST为60～300 IU/L，雌性大鼠AST为80～250
　　IU/L[14]。
　　各实验组的BUN，虽然在MSCs注射后，与同时间点的生理盐水对照组相比升高，但是与MSCs注射前相比，自身变化不大。即MSCs低剂量组和高剂量组大鼠，在MSCs注射前后BUN无显著性改变。有血清MSCs高剂量组的TC在D35与生理盐水对照组 相比有显著性升高，鉴于接近参考值（2.59 mmol/L）[14]，且属于个别异常，因此考虑与MSCs注射无关。
　　根据临床病理学数据分析的通用指导原则，临床病理学参数不能孤立地进行评价，当只有血液生化指标活性或浓度大于正常水平上限的2倍时， 说明脏器组织受到损伤[15]。上述血液生化指标虽然在MSCs注射后有所波动，但鉴于仍在参考范围内或接近参考范围上限，并且组织病理学未见明显与hUC-MSCs相关的病理组织学改变，因此说明hUC-MSCs对大鼠的物质代谢、肝、肾功能没有造成损害。
　　通过尾静脉移植的MSCs往往分布于肺、脾、肾、皮肤等含血量多的器官中[16]。本研究hUC-MSCs通过膝关节内局部注射，没有设计hUC-MSCs的定植和分化实验，已在正开展的研究中增加了该项实验。
　　总之，本研究表明膝关节内注射有血清培养体系和无血清培养体系的2种hUC-MSCs，没有引起大鼠一般生命体征、GVHD评分、血常规、T淋巴细胞亚群、血清细胞因子、尿常规和组织病理学明显改变，对实验大鼠无明显毒性作用。本研究为hUC-MSCs的膝关节临床应用提供了数据支持。
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