余甘子对大鼠酒精性脂肪肝的炎症抑制作用研究

来源:用户上传      作者: 俞宏斌 朱炜 戴 闯 冯文明

　　[摘要] 目的 观察余甘子对大鼠酒精性脂肪肝中炎症反应的抑制作用。 方法 通过高脂及乙醇混合饲料喂养大鼠8周以诱导酒精性脂肪肝的形成，同时每日给予一部分大鼠余甘子萃取物0.06 mL/g以研究余甘子的保护作用。8周后检测各组大鼠血生化和肝脏中相关炎症指标。 结果 相较于对照组，酒精肝大鼠血清中谷丙氨酸转氨酶（ALT）和天门冬氨酸转氨酶（AST）显著上升（P ＜ 0.01），肝组织切片中可见明显炎症位点及脂肪颗粒累积，肝脏中炎症因子（TNF-α，IL-1β和COX-2）的表达量亦显著上升（P ＜ 0.01）。加入余甘子协同处理的大鼠以上指标均有明显改善（P ＜ 0.05或P ＜ 0.01）。 结论 在大鼠酒精肝模型中余甘子对酒精肝有治疗作用。
　　[关键词] 酒精性脂肪肝；余甘子；炎症
　　[中图分类号] R575.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2012）04-0009-03
　　
　　Ameliorative effect of Phyllanthus emblica on inflammatory response in rat alcoholic fatty liver disease model
　　YU Hongbin ZHU Wei DAI Chuang FENG Wenming
　　Department of General Surgery & Institute of Molecular Surgery, the First People's Hospital of Huzhou, Huzhou 313000, China
　　[Abstract] Objective To investigate the ameliorative effect of Phyllanthus emblica on inflammatory response in rat alcoholic fatty liver disease (AFLD) model. Methods Rats were fed high-fat and ethanol diet for 8 weeks to induce AFLD. During the development of AFLD, some of the rats were injected with 0.06 mL/g extracts of Phyllanthus emblica per day. After 8 weeks, serum and hepatic samples were collected for measurements. Results AFLD rats showed significantly higher levels of ALT and AST in serum (P ＜ 0.01). Fat accumulation and inflammatory sites were also seen in AFLD rat livers, accompanied by up-regulation of hepatic pro-inflammatory mediators (P ＜ 0.01). Co-treatment of Phyllanthus emblica effectively ameliorated AFLD phenotypes (P ＜ 0.05 or P ＜ 0.01). Conclusion Phyllanthus emblica plays protective roles in rat AFLD model.
　　[Key words] Alcoholic fatty liver disease; Phyllanthus emblica; Inflammation
　　
　　过量饮酒或饮用其他酒精性饮料是全球范围内引发各种慢性疾病的重要诱因之一。2004年全球约3.8%的个体死亡原因与酒精的摄取有关。长期过量饮酒（即每日超过20 g酒精）可能会诱导脂肪性肝炎、酒精性脂肪肝（酒精肝），甚至肝硬化和肝癌的形成[1，2]。饮酒相关的健康问题已经成为我国所面临的一大公共卫生和社会问题[3]。酒精肝的致病因素单一，但是其发生机制非常复杂，目前尚未完全清楚。有研究指出，酒精摄入后导致的脂肪性肝炎是酒精肝形成过程中不可或缺的阶段，所以针对酒精肝的炎症抑制可能是一种有效的治疗策略[4]。
　　余甘子（Phyllanthus emblica L.），又名油柑子、橄榄子、滇橄榄等等，为大戟科叶下珠属植物余甘子的成熟果实，是一种常用藏药。现代药理研究发现余甘子是一种有效的抗氧化剂，同时亦有许多抗病方面的效用，包括止痛、抗菌、抗炎症、防突变、抗肿瘤以及肝脏保护等等[5]。另外有研究发现，在大鼠肝纤维化模型中，余甘子可以降低大鼠肝脏纤维化指标因子，同时通过提高超氧化物歧化酶（SOD）活性和降低促炎症因子水平发挥抗氧化和抗炎症的作用。由于氧化应激和炎症的出现亦是酒精肝的标志事件，该研究提示余甘子可能在酒精肝模型中发挥着类似的作用[6]。迄今为止，尚未有关于余甘子预防和治疗酒精肝疾病的报道，所以本研究通过高脂混合乙醇饲料诱导大鼠形成酒精肝，通过观察诱导酒精肝的同时给予余甘子对大鼠各项组织学和生物化学指标产生的影响，以研究余甘子对大鼠酒精肝的保护尤其是对炎症反应的抑制作用。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料
　　雌性Wistar大鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供；余甘子萃取流程参考王文光等[7]方法：取大约5 g研磨自晾干的余甘子果实的粉末，在40 ℃条件下溶于100 mL三蒸水中约1 h。待溶液降到室温后，通过Whatman滤纸过滤，收集液体萃取物放置于避光的4 ℃环境备用。余甘子液体萃取物中包含约86%水分、7%糖类、3.4%的抗坏血酸（维生素C）、2.2%的单宁酸和0.7%的类黄酮；谷丙氨酸转氨酶（ALT）和天门冬氨酸转氨酶（AST）检测试剂盒购于TECO Diagnostics公司；肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）和环氧合酶-2（COX-2）的引物设计均基于Genbank数据库并参考Primer Bank数据库。引物序列如表1所示。引物合成由宝生物工程有限公司完成。三种基因的抗体均购自于Santa Cruz公司；SV Total RNA试剂盒购自于Promega公司；SYBR ExScript RT-PCR购于Takara公司；总蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 酒精肝动物模型的建立 大鼠酒精肝模型参考Tipoe GL的建模方法[8]。雌性Wistar大鼠（200～220 g）适应性喂养5 d后分为三组：对照组、酒精肝组和酒精肝余甘子协同处理组，每组6只大鼠。对照组喂养普通大鼠饲料和纯净水。酒精肝组和酒精肝余甘子协同处理组每日喂饲包含8%酒精、鱼油、蛋白质和葡萄糖的饲料8周以诱导酒精肝的形成。同时，酒精肝余甘子协同处理组每日另注射0.06 mL/g的余甘子萃取物。8周后取各组大鼠的肝脏组织和血清进行组织学和生物化学测定。

　　1.2.2 组织学分析 肝脏组织固定于10%的磷酸盐缓冲的福尔马林中，然后以石蜡包被制成5 μm厚的组织切片。切片使用苏木精-伊红双染法进行肝脏内脂肪堆积的评分分析。脂肪堆积评分标准：脂肪颗粒占背景0～25%的区域为1分；25%～50%为2分；50%～75%为3分；75%以上为4分。
　　1.2.3 RNA提取和反转录 大鼠肝脏组织经液氮研磨后使用SV Total RNA试剂盒提取总RNA，随后根据SYBR ExScript RT-PCR试剂盒的说明将总RNA反转录为cDNA，置于-20℃下保存。
　　1.2.4 荧光实时定量PCR（Real-time PCR） Real-time PCR按照SYBR ExScript RT-PCR建议的体系和条件于Applied Biosystems Prism 7900 Real-time PCR仪器上完成，所有引物的退火温度均优化至60 ℃。人类GAPDH作为内参照进行同步PCR扩增（表1）。Real-time PCR结果使用2-ΔΔCt法进行分析并以对照组百分数的形式于结果中表示。
　　1.2.5 免疫印迹分析（Western blot） 按照总蛋白试剂盒的方法提取肝脏组织总蛋白后使用BCA法（Bio-Rad）定量，每个样品取150 μg总蛋白进行免疫印迹分析。
　　1.3 统计学处理
　　实验结果采用SPSS 11.0软件进行统计学分析。采用方差分析，两两比较时采用SNK法，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 余甘子对酒精肝内肝损伤的保护
　　大鼠经高脂混合乙醇饲料喂养8周后，与正常组相比，肝脏小叶中央静脉附近出现明显的细胞坏死和炎症部位，同时整个肝脏中可见大量脂肪颗粒堆积。加入余甘子协同处理后，肝内坏死及炎症部位显著减少，脂肪堆积评分分值明显下降（图1及表2）。此外，相比较于对照组，酒精肝大鼠血清中ALT和AST的表达量显著上升（P值分别为0.005 8和0.007 9），提示肝损伤的发生。加入余甘子协同处理后，大鼠血清中ALT和AST下降到与对照组大鼠接近的水平（P值为0.033 1，表2）。
　　2.2 余甘子对肝内促炎症因子的影响
　　与对照组相比，酒精肝大鼠肝内TNF-α、IL-1β和COX-2的mRNA及蛋白表达水平均显著上升（P值分别为0.000 7、0.007 2和0.000 3），提示肝内存在相当程度的炎症反应。加入余甘子协同作用后，相比较于酒精肝组大鼠，三种促炎症因子的表达水平均有显著下降，其中TNF-α和IL-1β下降到接近对照组的水平（P值分别为0.006 4、0.008 8和0.003 9，图2）。
　　3 讨论
　　本研究通过参考Tipoe GL等[8]的酒精性脂肪肝建模方法，利用高脂肪饲料辅以酒精自由喂饲8周成功建立了雌性大鼠酒精肝模型。从血清生化指标、肝脏组织学检验和肝内炎症因子的表达来看，本模型基本复制了酒精肝中各种标志性病理事件。同时相比于雄性大鼠，雌性大鼠对于酒精肝的耐受能力更差，所以本模型完全以雌性大鼠作为研究对象，以期获得更为明显的酒精肝损伤。在诱导酒精肝形成的8周内我们通过每日注射0.06 mL/g的余甘子萃取物作为协同处理，有效地减少了肝脏内细胞坏死、炎症部位的出现和脂肪颗粒的堆积，同时亦将血清内提示肝损伤的ALT和AST表达量降低到了对照组水平，提示余甘子对由酒精肝引起的肝脏损伤具有有效的保护作用。在分子生物学的角度上，酒精肝大鼠中TNF-α、IL-1β和COX-2的表达水平明显升高，提示酒精肝中肝内发生了严重的炎症反应。而余甘子的协同处理从基因转录水平和翻译水平上均显著降低了此三种促炎症因子的表达水平，亦反映了余甘子对炎症反应的抑制作用。
　　虽然酒精肝的发病机制非常复杂，现在并未完全研究清楚[9]，但是一般认为在摄入乙醇后，在肝内乙醇脱氢酶（ADH）、细胞色素P450 2E1（CYP2E1）和过氧化氢酶（catalase）三套系统的作用下乙醇被氧化为乙醛，然后在线粒体中通过乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase）的作用转化为醋酸盐。这些代谢过程中会在肝细胞、炎症细胞及非实质细胞中产生对机体有害的自由基（ROS），提高体内氧化应激水平，进而攻击细胞内的一些细胞器，例如线粒体、内质网和细胞核等，引起炎症反应和启动细胞凋亡通路。在ROS的攻击下，肝脏内的Kupffer细胞会释放出一些促炎症因子，例如TNF-α、IL-1β和COX-2，引起炎症反应、纤维化反应以及进一步促进ROS的释放，恶化已有的酒精肝损伤[10]。余甘子对于肝脏细胞内炎症的抑制不仅阻止了炎症损伤和细胞凋亡坏死，也明显改善了肝内脂肪堆积，扭转了酒精肝的病理进程。但是余甘子是否能够改善肝内氧化应激以及纤维化水平需要进一步的研究。
　　本研究结果证实在诱导酒精肝的同时加入余甘子同步处理可以明显改善肝脏内损伤，降低肝内炎症反应，起到促进酒精肝恢复的效果。
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　　（收稿日期：2011-11-11）

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