运动性低血色素大鼠骨骼肌有氧氧化能量代谢系统的变化研
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作者: 张毅
摘要：为进一步研究改善贫血状况和采用恢复手段促进骨骼肌的快速恢复打下基础。方法：将20只Wistar大鼠随机分为安静对照组（n=10）和运动组（n=10）。采用7周递增负荷跑台运动建立运动性低血色素大鼠模型，建模成功后第二天宰杀大鼠，取骨骼肌和肝脏测定肌糖原、肝糖原含量，并测定骨骼肌的SDH活性和UCP3mRNA表达。结果：1)7周递增负荷跑台运动导致了运动大鼠红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积显著降低（P＜0.05），建模成功；2)运动性低血色素并未影响大鼠肌糖原和肝糖原的恢复(P＞0.05)；3)运动性低血色素大鼠骨骼肌SDH活性非常显著降低（P＜0.01），使得UCP3mRNA表达非常显著增多（P<0.01）。结论：运动性低血色素不影响肌糖元和肝糖原的恢复速度，但是可以显著降低骨骼肌琥珀酸脱氢酶的活性，提示运动性低血色素状态可能使骨骼肌有氧氧化能力降低；运动性低血色素大鼠骨骼肌UCP3mRNA表达显著增加，可能与UCP发挥运动抗氧化的快速应答有关。
关键词：运动性低血色素；骨骼肌；糖原；琥珀酸脱氢酶；骨骼肌解偶联蛋白3
中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1007-3612(2011)12-0049-03
The Changes of Hepatic, Muscle Glycogen and Succinate Dehydrogenase 3mRNA Expression in
Skeletal Muscle of Sport Low Hemoglobin Rats
ZHANG Yi
(P.E.Dept., Shantou University, Shantou 515063, Guangdong China)
Abstract:To observe the changes of hepatic, muscle glycogen and succinate dehydrogenase 3mRNA expression in skeletal muscle of sport low hemoglobin rats and to provide a reference for further study on the recovery of the skeletal muscle motor capacity with sports anemia. Method：20 Wister rats were divided into two groups: silent control group (n=10) and training group (n=10). After seven weeks increase mental treadmill exercise, the model of sports anemia was built up. All rats were killed during 24H after training. The Glycogen in liver and skeletal muscle，SDH activity and expression of UCP3mRNA were to be detected and observed.Results:1)Compared with silent control group, the RBC, Hb and HCT of training group decreased significantly(P<0.05), so the model was successful; 2)There was no significant change in the recovery of the muscle and hepatic glycogen in sports anemia rats(P＞0.05); 3)In sports anemia status，the SDH activity decreased highly significantly（P＜0.01）; 4)Expression of UCP3mRNA were increased significantly in sports anemia rats（P＜0.01）. Conclusions: 7 weeks increasing treadmill exercise can make rats appear symptoms of low hemoglobin; Sport low hemoglobin did not affect recovery speed of muscle and hepatic glycogen; the activity of SDH significantly reduce, and increased expression of UCP3mRNA. This may be the reasons that sport low hemoglobin can decrease the rate of athletic aerobic oxidation.
Key words: sport low hemoglobin；skeletal muscle；glycogen；succinate dehydrogenase；UCP3
运动性低血色素是运动员在运动训练期间易于出现的一种现象，表现为血红蛋白浓度的显著降低和氧转运能力的下降，进而影响运动员身体机能状态和有氧运动能力。Gregg等发现急性贫血使大鼠的V・O2max明显降低，耐力运动能力降低［1］。糖作为能源物质，在机体运动时的能量代谢中有十分重要的作用，徐晓阳等［2］研究证实，长时间大强度耐力训练可以明显提高安静时大鼠股四头肌的肌糖原含量，而力竭运动后即刻股四头肌肌糖原含量显著降低。当运动训练造成血红蛋白显著降低时（运动性低血色素）是否会机体糖原恢复目前研究报道较少。另一方面运动员在持续高强度运动中，ATP再合成速率降低导致能量代谢紊乱，是导致运动性疲劳的主要因素。琥珀酸脱氢酶作为有氧氧化的限速酶起到关键的作用，UCP3通过调节质子的跨线粒体内膜运输影响线粒体内膜两侧的质子梯度影响ATP的产生，与ATP生成关系密切。有研究报道［3，4］，慢性缺氧导致小鼠肺组织中SDH活性增加显著，并且在缺氧期间始终处于较高的水平。因此，慢性缺氧可能是通过提高有氧代谢系统的相应酶活性，以提高有氧代谢效率达到细胞适应的。但有关运动性贫血对UCP3mRNA表达的影响从而如何影响ATP生成目前还没有看到相关报道。运动性低血色素引起机体有氧运动能力降低时，有氧代谢系统相关酶活性以及UCP3mRNA表达等的变化规律这有待进一步探讨。
运动训练造成的运动性低血色素状态时是否会影响机体内糖原的恢复速率以及影响有氧氧化酶与骨骼肌蛋白活性，进而影响机体的耐力水平，这是值得探讨的。本研究首先建立运动性低血色素模型，进而探讨机体内糖原合成速率和有氧氧化酶的活性，以探讨运动性低血色素对机体有氧代谢系统的影响。
1材料与方法
1.1实验动物与分组7周龄雄性Wistar大鼠20只，由中山医科大学动物中心提供。大鼠购进后适应饲养一周，随机分为2组：安静对照组10只，平均体重(188.9±7.4)g、运动组10只，平均体重(187.9±7.2)g。分笼饲养，每个鼠笼5只，全价动物饲料正常饲养，自由饮食，动物饲养环境温度(24±1)℃，湿度45%～65%。
1.2实验方法运动训练组大鼠进行递增负荷跑台训练，时间为7周，动物训练方式依据郑弘溶［6］的运动性低血色素模型进行，所有训练过程中完全按照其要求进行。
1.3取材与测试指标
1.3.1血红蛋白浓度监测于每周训练结束后的24 h，对各组大鼠进行断尾取血20 μL，肝素抗凝处理血样，血细胞分析仪KX-21测定各组大鼠血红蛋白（Hb）、红细胞计数（RBC）和红细胞比积（Hct）等指标，监控运动大鼠血红蛋白浓度的变化。
1.3.2标本取材最后一次训练结束后24 h，腹腔注射20％乌拉坦溶液以麻醉大鼠，处死大鼠后取肝脏左中叶大约1 mm×1 mm×4 mm左右长方体样本和300 mg左侧腓肠肌，预冷生理盐水洗净，并用滤纸吸干水分，锡箔纸包好投入液氮中保存待测肌糖原和肝糖原含量、SDH、骨骼肌UCP3mRNA表达。各组织在液氮冻存后转置－80℃低温冰箱保存。
1.3.3肝糖原和骨骼肌糖原含量测定采用比色法测定糖原含量。肝糖原及骨骼肌糖原含量测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所，严格按试剂盒说明书操作。匀浆液中蛋白测定采用考马斯亮兰法。
1.3.4骨骼肌SDH活力的测定采用SDH测定试剂盒测定骨骼肌SDH活力，购自南京建成生物工程研究所，严格按试剂盒说明书操作。
1.3.5骨骼肌UCP3mRNA表达测定取待测样品的cDNA,按照荧光定量PCR试剂盒的说明进行操作。反应总体积20 μL，cDNA为1～2 g上游引物终浓度0.5 μmol/L，下游引物终浓度0.5 μmol/L，反应条件:95℃1 min；95℃，15 s及60℃，60 s，共40个循环最后做溶解曲线，以确定扩增产物的特异性。所有样品均重复检测3次，并计算所检测样品相对于作为参照因子样品的目的基因的表达倍数。
1.4统计学处理方法实验数据采用SPSS11.5软件包进行单因素方差分析检验，显著性水平为P<0.05，非常显著性水平为P<0.01。实验数据由平均数±标准差表示。
2结果
2.1运动性低血色素大鼠模型的成功建立
2.1.17周递增负荷跑台运动对大鼠血细胞指标的影响实验结果表明运动组大鼠红细胞计数、血红蛋白浓度以及红细胞比积均显著低于安静对照组（P＜0.05），说明本实验采用7周递增负荷跑台训练成功建立了运动性低血色素大鼠模型（表1）。
表17周递增负荷运动后血细胞指标的变化
血红蛋白/g・L-1红细胞计数/×1012・L-1红细胞比积/％安静对照组145.60±6.777.74±0.590.44±0.03运动组125.00±21.01*6.34±1.10*0.39±0.07*注：*表示与安静对照组差存在显著性（P<0.05）；注：a*表示与安静对照组差存在非常显著性（P<0.01）。以下各表同。
2.2运动性低血色素大鼠体重和体征、行为的变化运动前各组大鼠体重无显著性差异，运动组大鼠由于承受递增跑台运动，从第一周开始一直到7周训练结束运动组大鼠体重均非常显著低于安静对照组(表2)。
3分析与讨论
3.1运动性低血色素模型的建立正常情况下大鼠红细胞的生成与破坏处于动态平衡，并且大鼠的适应能力较强。为了造成运动性低色素大鼠模型，采用郑弘溶［6］的运动性低血色素动物训练模型，采用递增强度幅度变化较大的跑台运动，在7周训练期使运动组大鼠始终处于应激状态，避免大鼠对运动负荷产生适应，从而使大鼠的红细胞破碎大于生成。运动组大鼠体重从第二周开始显著低于安静组，这也证实了递增负荷运动导致了运动大鼠处于应激状态，合成代谢受到抑制，分解代谢占据主导地位，表现为体重增长缓慢。
本实验7周递增负荷跑台运动导致了运动组大鼠红细胞计数、血红蛋白浓度以及血球压积均显著低于安静组，表明运动性低血色素大鼠模型成功建立。
3.2运动性低血色素大鼠肝糖原和骨骼肌糖原含量变化糖是大强度运动时最为重要的供能物质。当运动过程中氧供应不足时机体会激活糖酵解供能系统参与供能，快速消耗肌糖原生成乳酸，迅速再合成ATP以满足大强度运动时的能量需要，肌糖原的储备量的多少是影响长时间亚极量运动能力的关键因素。运动时肝糖原的主要作用是维持血糖平衡，血糖是中枢神经系统的主要燃料，长时间运动时维持血糖平衡是保证中枢神经系统充足能量供应的前提，而肝糖原储备的多少是影响肝脏是否葡萄糖维持血糖平衡的重要因素。
机体对运动训练具有较强的适应性，这是运动能力提高的关键。长时间运动时机体糖原储备消耗越明显则在运动后恢复期胰岛素敏感性越高，糖原合成酶以及葡萄糖转运能力都适应性增加，这时机体适应运动训练的结果。Tan［7］和Hickner［8］等实验研究结果表明，受试对象无论是人或是动物经过长期耐力训练后恢复期肌糖原合成速率都明显增加。魏守刚［9］等研究结果表明，经过长期耐力运动大鼠在运动后24 h其肌糖原合成速率和合成量显著高于未经训练的大鼠。本实验结果证实运动组大鼠在末次运动后24 h肝糖原含高于安静组，但无显著性差异，而肌糖原含量运动组大鼠显著高于安静组（P<0.05），这与以往的研究报道一致，运动性低血色素未影响运动训练所引起的肌糖原适应性的增加。由于本实验并不显著运动组大鼠的饮食，运动训练引起的糖原储备的大量消耗，运动后机体糖原合成速率的适应性增加，从而保证了运动后24 h肌糖原合成增加，使得运动组大鼠肌糖原含量显著高于安静组（由于没有运动训练刺激，肌糖原合成维持在原有水平）。运动后糖原恢复的规律是肌糖原先恢复，然后是肝糖原的恢复，本实验证实了此现象。
3.3运动性低血色素大鼠骨骼肌琥珀酸脱氢酶（SDH）活性以及UCP3mRNA表达的变化长时间大强度的运动训练是以糖有氧氧化供能为主，线粒体是有氧氧化的发生部位。线粒体能量代谢速率急剧增加以适应运动之需要，同时线粒体呼吸链电子传递加速造成电子漏增多产生自由基显著增加，自由基生成增加攻击线粒体膜的多不饱和脂肪酸，脂质过氧化增加，同时自由基还会攻击生物大分子酶、收缩蛋白以及核酸，出现交联或断裂，影响生物大分子的生物活性。因此运动训练造成的自由基代谢紊乱是引起细胞膜损伤和破坏加强的重要原因，也是红细胞破坏增加、血红蛋白浓度降低的主要因素，是导致运动性低血色素发生的诱因［10］。
SDH位于线粒体内膜上，是三羧酸循环中唯一与线粒体内膜结合的酶，其催化琥珀酸生成延胡索酸，直接与线粒体电子传递系统偶联，与ATP的生成密切相关。SDH作为线粒体的标志酶，是反映线粒体损伤状况的敏感指标。Hetch［11］研究报道表明由于多种因素引起的心肌缺血再灌注首先出现的是SDH活性的变化，其变化规律与线粒体膜结构的改变关系最为密切。目前在体育科研中通常测定SDH的活性来反映运动训练或是营养干预对细胞有氧代谢能力的影响。本实验结果表明7周递增负荷跑台运动造成了运动性低血色素大鼠骨骼肌线粒体SDH活性的非常显著的降低（P<0.01），这可能是由于长期递增负荷运动造成了自由基代谢的紊乱，引起线粒体膜发生脂质过氧化增加，引起与线粒体膜结合的SDH活性的显著降低，提示当发生运动性低血色素时大鼠骨骼肌线粒体有氧氧化能力下降，这可能也是发生运动性低血色素时影响运动能力的一个原因。
解偶联蛋白（UCP）是位于线粒体内膜介导质子漏的转运蛋白家族，UCP通过催化跨线粒体内膜运输来降低线粒体内膜两侧的离子梯度从而使得离子透出增加，导致产热增加，ATP的生成减少［11］。UCP3是骨骼肌中表达量最高的亚型，具有调节线粒体活性氧产生和脂肪酸转运的功能［12］。UCP3mRNA表达量增加与长时间激烈运动诱导的骨骼肌线粒体活性氧（ROS）增加有关，运动中UCP3mRNA表达量增加可能具有抑制ROS生产的作用。本实验结果可见7周递增负荷训练使得运动组大鼠骨骼肌UCP3mRNA表达量出现显著增加，这表明长时间递增负荷训练使得大鼠骨骼肌线粒体ROS生产增加，从而使得运动组大鼠线粒体质子漏产生增多，引起骨骼肌UCP3mRNA表达量相应增加，UCP3mRNA表达增加可能是机体对抗运动训练造成的ROS增加的一种适应性变化［13］。
4结论
1)本实验通过7周递增负荷跑台训练造成大鼠血红蛋白浓度、红细胞压积、红细胞计数的显著降低，说明本实验成功建立大鼠低血色素模型。
2)运动性低血色素并未影响大鼠肌糖原和肝糖原含量的恢复；运动性低血色素大鼠骨骼肌琥珀酸脱氢酶活性明显降低，提示低血色素状态时骨骼肌有氧氧化能力可能会降低。
3)运动性低血色素大鼠骨骼肌UCP3mRNA表达增加，可能与UCP发挥运动抗氧化的快速应答有关。
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