姜黄素诱导前列腺癌细胞DU145凋亡的研究
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作者: 王建兵 周敬敬 马艳 周华友 陈曲波
【摘要】目的:研究姜黄素对雄激素非依赖性前列腺癌DU145细胞的体外生长活性、诱导细胞凋亡作用。方法 DU145细胞经不同浓度（10, 20, 40, 80mol /ml）姜黄素作用24h、48h、72h，以四氮甲唑蓝（MTT）比色法观察细胞增殖效果，流式细胞术测定细胞凋亡，以仅加入培养液没有药物处理作为空白对照组。结果 姜黄素作用于DU145细胞24h、48h、72h，MTT结果表明细胞生长受到抑制，呈现时间剂量依赖性。流式细胞术结果确定细胞发生凋亡，20, 40, 80mol /ml浓度组的凋亡细胞比例均显著高于对照组，差异有显著性意义（P<0.05）。结论 姜黄素可能通过诱导DU145 细胞凋亡来发挥其抗肿瘤作用。
【关键词】姜黄素；肿瘤；凋亡
【中图分类号】R737.25【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）10-0099-02
前列腺癌（Prostate Cancer,PCa）是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一[1]。在西方国家，前列腺癌发病率居男性恶性肿瘤第2位。在我国，前列腺癌也是一种常见的男性恶性肿瘤，随着人口寿命的延长和生活方式的变化，加上诊断技术的发展使得确诊率不断提高，前列腺癌的发病率也呈逐年上升的趋势，近年已列泌尿系肿瘤的第3位，且发病年龄日趋年轻化，严重影响了我国男性健康。
中药复方或单味药的有效成分具有抑制肿瘤细胞生长的作用己有多方面的报告[2-3]，本实验通过观测姜黄素不同浓度、不同作用时间对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株DU145进行体外干预，观察抑制细胞增殖效果和诱导细胞凋亡情况，希望能通过本实验研究，为姜黄素治疗前列腺癌提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
雄激素非依赖性前列腺癌细胞系DU145细胞购自中科院上海细胞库（ATCC），姜黄素购自广州医药工业研究所。
1.2主要试剂
RPMI1640培养基高糖型购自美国Gibco公司，优级胎牛血清（FBS）购自TBD公司。TRYPSIN 0.25% EDTA胰酶、碘化丙啶（PI）、RNaseA酶、青霉素、链霉素、谷氨酰胺（L-glutamine）、MTT、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司。
1.3 设备
多功能酶联免疫分析仪，HARRIS二氧化碳培养箱、HEPA class100培养箱；NIKON倒置显微镜、BECKMAN流式细胞分析仪。
1.4 MTT试验法分析其体外抗肿瘤活性
（1）将培养细胞稀释至2.5×103 -50×103个/ml, 用加样器在平底96孔板的各孔中加入200μl细胞悬液，每孔加0.5×103-10×103 个细胞，将200μl无菌PBS加至上下两行及左右两列的孔中。
（2）5%CO2，37℃孵育，等细胞进入指数生长期时可加入浓度梯度的药物,用培养基将中药提取物按按倍数稀释，共制备4个浓度。
（3）空白对照组培养液中只加入等量的培养液，没有药物，其余各孔细胞中加入10, 20, 40, 80mol /ml姜黄素中药提取物。每个药物浓度设6个复孔，并向每组6 孔中各加入200μl药物溶液。
（4）24h、48h、72h后所有孔中各加入10μl MTT，用铝箔包裹培养板，于37℃避光温育4 h。
（5）终止培养，小心吸去孔内的培养基和MTT，所有孔中各加入200μl DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。立即在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值（A）。读板仪用第2列为各孔调零。分析以药物浓度为横坐标（X轴），吸光值为纵坐标（Y轴）绘制曲线图。每组实验重复3次。
计算抑制率（IR）: 抑制率(%)=(1-实验组A 均数/对照组A均数) ×100%
1.5 流式细胞仪检测Du145细胞凋亡率
（1）将各组中药处理24h,48 h，72h后的DU145细胞用少量胰蛋白酶消化，取106细胞，1000 r/min离心5min收集细胞。
（2）3ml PBS洗一次，离心弃上清，加入2ml冰预冷的70%无水乙醇，于4℃固定保存过夜。
（3）将固定的细胞离心去固定液，3mlPBS重悬5min , 1000 r/min离心5min，弃上清。再加入10ULRNase A,37℃水浴消化30 min。
（4）加入0. 2m1 PI荧光染料染色,20min室温避光，用流式细胞仪测定PI荧光强度,计算凋亡细胞百分率。
1.6 统计学处理
采用SPSS13.0软件对数据进行方差分析。所有数据以均数±标准差（±s） 表示，配对资料采用t检验进行统计分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 MTT比色法实验结果
低剂量（10mol /ml）的姜黄素对DU145细胞生长没有明显的抑制，72h时抑制率仅为13.87%。但是，随着药物浓度的增加，细胞抑制率明显增加，80mol /ml的姜黄素作用于DU145细胞72h后，抑制率可达到66.92%，呈现出药物浓度剂量依赖性。
同一浓度的姜黄素作用DU145细胞24h、48h、72h后，细胞生长抑制情况明显变化，随着作用时间的延长，细胞生长抑制率逐渐增加，在80mol /ml的姜黄素作用DU145细胞24h抑制率为（32.13％），48h抑制率为（44.74％），72h抑制率为（66.92％），呈现时间依赖性抑制，见表1。
表1 姜黄素作用DU145细胞抑制率变化(,%)
注: 与相应对照组比较, *P <0.05
2.2姜黄素诱导Du145细胞凋亡的实验研究
10,20,40,80mol/ml的姜黄素作用于DU145细胞24h、48h、72h后，流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示：细胞凋亡率随着药物浓度增加而递增，随作用时间的延长而增加，呈现时间、剂量依赖性。
表2 姜黄素诱导DU145细胞凋亡率变化 (,%)
注: 与相应对照组比较, *P <0.05
3 讨论
近年来，前列腺癌发病率呈逐年上升趋势，已成为危害男性健康的重要疾病，因此寻找前列腺癌的有效治疗方法是目前的首要任务。
已有研究表明姜黄素能够选择性地抑制多种肿瘤细胞的体外生长，而对于泌尿系统肿瘤，姜黄素也具有较强的肿瘤生长抑制作用。Sindhwani等[4]报道姜黄素可明显降低C3H小鼠膀胱细胞系MBT-2膀胱移植癌的成瘤率。Dorai等[5]报道姜黄素口服给药可以显著抑制裸鼠皮下接种雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP的成瘤率。本研究对不同浓度的姜黄素作用于非依赖型前列腺癌DU145，采用MTT比色法检测抗癌药物姜黄素对肿瘤细胞增殖活性的影响，证明姜黄素对DU145细胞的生长具有明显的抑制作用，呈计量和时间依赖性。该方法简便快速，所需细胞数目较少，便于大规模进行药物敏感性试验，加之人为误差较小而且结果稳定、精确，没有放射性污染，目前已广泛用于临床前抗癌药物的筛选研究。
本实验通过PI-流式细胞仪检测发现不同浓度姜黄素处理DU145细胞24h、48h、72h后，细胞凋亡率均大于对照组，且随着姜黄素浓度的增加，细胞凋亡率增加；同一浓度姜黄素作用下，随着作用时间的延长，细胞凋亡率也增加。80mol/ml的姜黄素作用DU145细胞72h，出现细胞早期凋亡，凋亡率可达到87.13%，比对照组明显增高，显示较强的诱导前列腺癌细胞凋亡的作用。
综上所述，姜黄素可以明显抑制雄激素非依赖性前列腺癌DU145细胞的体外增殖并诱导其凋亡，因此有希望成为预防和治疗前列腺癌的新药物，本实验为姜黄素应用于前列腺癌的治疗提供了实验依据，但尚需进一步深入研究其抗肿瘤的机制。
参考文献
[1]Fulda S，Debatin KM．Sensitization for tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand-induced apoptosis by the chemopreventive agent resveratro1 [J]．Cancer Res，2004，46 (1)：337―346．
[2]邵勤，官阳，杨木兰，等．大黄素抑制PDGF诱导的肝癌细胞增殖[J]．中华肿瘤防治杂志，2007，14(7)：514―517．
[3]Keum YS，Han SS，Chun KS，el a1．Inhibitory effects of the ginsen―oside Sg3 on phorbolester―induced cyclooxygenase一2 expression，NF-kappaB activation and tumor promotion．Murat Res．2007．523―524：75―85．
[4]Sindhwani P,Hampto JA,Baig MM, et a1. Curcumin prevents intravesical tumor implantation of the MBT-2 tumor cell line in C3H mice[J]．JUrol，2001；166(4)：1498-1501.
[5]Dorai T,Cao YC, Dorai B, et a1. Curcumin inhibits proliferation,induces apoptosis,and inhibits angiogenesis of LNCaP prostate cells in vivo[J].Prostase,2001，147(4)：293-303.
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