德国小蠊酸性磷酸酯酶测定条件的方法研究

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　　摘要： ［目的］ 探索德国小蠊（Blattella germanica）酸性磷酸酯酶的最佳测定条件。［方法］ 采用二次回归通用旋转组合设计方法建立德国小蠊酸性磷酸酯酶测定中缓冲液pH值、反应温度、水浴时间、底物浓度等测定条件的数学模型，根据该模型寻求测定条件的最优组合。［结果］ 本次试验得到回归方程yˆ = 0.181 57 - 0.012 08x1 + 0.028 75x2 + 0.025 58x3 - 0.003 83x4 + 0.001x1 x2 - 0.006 13x1 x3 + 0.000 625x1 x4 + 0.010 63x2 x3 + 0.000 125x2 x4 + 0.000 25x3 x4 - 0.008 37x12 - 0.002 62x22 - 0.004 75x32 - 0.009 87x42（R2 = 0.915 6，Se = 0.000 612 57）。方程的失拟性检验F = 3.59 < F 0.05（10，6） = 4.06（P > 0.05）；回归方程的显著性检验F = 12.39 > F0.01（14，16） = 3.45（P < 0.000 1）；表明模型合适，二次回归方程有统计学意义。 ［结论］ 德国小蠊酸性磷酸酯酶的最佳测定条件是在波长400 nm下醋酸缓冲液pH值为4.42、反应温度为47 ℃、水浴50 min、底物浓度为7.5×10-3 mol/L。
　　关键词：德国小蠊；酸性磷酸酯酶；二次通用旋转组合设计
　　
　　Methodological Research of Testing the Acid Phosphatase of Blattella GermanicaCAI Hui-zhen，SHEN Xiao-bing*（School of Public Health，Southeast University，Nanjing 210009，China）
　　Abstract：［Objective］ To find the best testing condition of the acid phosphatase of Blattella germanica. ［Methods］ Quadratic general rotary unitized design was used to study the relationship between buffer pH，temperature，reaction time，substrate concentration and absorbence，and to find the best combination of those test conditions. ［Results］ For the result regression equation we got，yˆ = 0.181 57 - 0.012 08x1 + 0.028 75x2 + 0.025 58x3 - 0.003 83x4 + 0.001x1 x2 - 0.006 13x1 x3 + 0.000 625x1 x4 + 0.010 63x2 x3 + 0.000 125x2 x4 + 0.000 25x3 x4 - 0.008 37x12 - 0.002 62x22 - 0.004 75x32 - 0.009 87x42（R2 = 0.915 6，Se = 0.000 612 57）. There has no missing critical factors for the equation（F = 3.59 < F0.05（10，6） = 4.06，P > 0.05）and there was statistically significance（F = 12.39 > F0.01（14，16） = 3.45，P < 0.000 1）. It showed that the equation was suitable for testing. ［Conclusion］ The enzyme to be tested is in its highest activity under the combination of following conditions：buffer pH 4.42，temperature 47 ℃，reaction time 50 minutes，substrate concentration 7.5×10-3 mol/L and analyzing wave length of the enzyme is 400 nm.
　　Key Words：Blattella germanica；acid phosphatase；quadratic general rotary unitized design
　　德国小蠊（Blattella germanica）的抗药性问题已成为制约其化学防制效果的关键因素。现有的抗性测定方法不仅需要大量的测试昆虫、多次重复，而且灵敏度也有较大的局限性。为了确定抗药性的发生和发展及其抗性水平，非常需要有适宜、快速、准确的抗药性检测方法。随着德国小蠊抗药性产生机制研究的深入，已知德国小蠊等病媒昆虫抗药性的产生与昆虫体内代谢酶及靶标酶的活性有关［1-4］。酸性磷酸酯酶是德国小蠊体内的主要代谢酶之一，其活性的改变将会影响杀虫剂的作用效果，导致抗药性产生［2］。因此酸性磷酸酯酶活性的测定对确定德国小蠊抗药性的产生及发展具有一定的意义。但是目前关于酸性磷酸酯酶测定条件的研究较少［5-6］，研究方法不统一，且测定条件多样，导致测定结果不稳定，给酸性磷酸酯酶活性的统一评价带来了困难，而德国小蠊酸性磷酸酯酶活性测定条件的研究还未见报道。因此有必要对德国小蠊酸性磷酸酯酶活性最佳测试条件进行摸索。本文应用二次回归通用旋转组合设计法［7-12］，对德国小蠊酸性磷酸酯酶的测定条件进行研究，以期建立敏感、稳定的德国小蠊酸性磷酸酯酶测试方法。
　　
　　1 材料与方法
　　1.1 试验方法
　　酸性条件下，酸性磷酸酯酶可以水解对硝基苯基磷酸二钠（即反应底物），产生黄色的对硝基苯酚。当底物含量足够时，该酶活性越强，所生成的对硝基苯酚也就越多，据此可应用比色法测定该酶的活性。因缓冲液pH值、水浴时间、反应温度、底物浓度均与吸光度有关，故本试验设计选择该4项因子（记作Zj）进行研究：Z1：缓冲液pH值；Z2：水浴时间（min）；Z3：反应温度（℃）；Z4：底物浓度（×10-3 mol/L）。
　　1.2 试验次数的确定及其试验因子的转换
　　1.2.1 试验次数的确定 在二次回归通用旋转组合设计试验中，其总试验次数n由3部分组成：①首先每个因子均取两个水平，编码为-1与1。采用两水平正交表安排试验，可以是全因子试验，也可以是1/2实施或1/4实施等。这部分的试验次数为mc，则mc = 2p，或2p-1（1/2实施）、2p-2（1/4实施）等。其中，p为实验因子的个数。②在每一因子的坐标轴上取两个试验点，该因子的编码值分别为-γ与γ，其他因子的编码值为0。由于有p个因子，因此这部分试验点共有2p个。常称这种试验点为星号点，其中γ（星号臂）= 。③在试验区域的中心进行m0次（由设计参数表获得）重复试验，这时每个因子的编码值均为0。

　　因此，n = mc + 2p + mo，且这n个点是分布在3个半径不相等的球面上，其中：mc个点分布在半径为ρc=的球面上；2p个点分布在半径为ργ=γ的球面上；mo个点分布在半径为ρo= 0的球面上。
　　本次试验共研究了4个因子，根据二次回归通用旋转组合设计试验的参数设计，本次试验的参数如下：p = 4；mc = 16；γ = 2；mo = 7（由参数设计表查得）； n = 31。
　　1.2.2 试验因素转换 参照二次回归通用旋转组合设计［7-12］，将本次试验因子转化为规范变量的因素水平，见表1。
　　
　　1.3 试验方法和安排
　　取室内饲养的德国小蠊雄虫若干只，取其中肠，加0.1 mmol/L冰冷醋酸缓冲液少许（pH值依表1而定）混合匀浆，于4 ℃、8 000 r/min，离心15 min，取上清液为酶源，待测。
　　根据4因子5水平二次回归通用旋转组合设计结构矩阵［11，12］，对31个组合进行试验，共重复3次，每次重复中各组合测2个样品，每样品测3次吸光度值。具体试验安排见表2。
　　2 结果
　　2.1 数学模型的建立
　　应用国际通用软件包SAS的REG过程拟合回归模型［9，11］，NLP过程求最优化配方［13］。方差分析表明，同一实验组合内其重复间和样本间差异均未达到显著水平。因此，本项目将每组合的样本平均值作为观测值建立数学模型。
　　根据通用方程：
　　
　　得到本次试验的回归方程：
　　yˆ = 0.181 57 - 0.012 08 x1 + 0.028 75 x2 + 0.025 58 x3 - 0.003 83x4 +
　　0.001 x1 x2 - 0.006 13 x1 x3 + 0.000 625 x1 x4 + 0.010 63 x2 x3 + 0.000 125 x2 x4 +
　　0.000 25 x3 x4 - 0.008 37 x12 - 0.002 62 x22 - 0.004 75 x32 - 0.009 87 x42
　　（1）
　　R2 = 0.915 6，Se = 0.000 612 57，回归方程的失拟性检验F = 3.59 < F0.05（10，6） = 4.06（P > 0.05）；回归方程的显著性检验F = 12.39 > F0.01（14，16） = 3.45（P < 0.000 1）；表明该模型合适，二次回归方程有统计学意义。方程可以很好地反映出缓冲液pH值、反应温度、水浴时间、底物浓度与吸光度之间的关系。
　　对模型中各回归系数做t检验，模型（1）中，b0、b2、b3达极显著水平（P < 0.000 1），b1、b23、b11和b44达显著水平（P < 0.05）。将模型（1）中不显著项去除得简化模型如下：
　　yˆ = 0.174 77 - 0.012 08 x1 + 0.028 75 x2 + 0.025 58 x3 + 0.010 63 x2 x3 - 0.007 66 x12 - 0.009 16 x42（2）
　　R2 = 0.881 0，由模型（2）可知缓冲液pH值、底物浓度只存在主效应，与其他因子之间没有交互作用；而水浴时间和反应温度的主效应达显著水准，且两因子间存在一定交互作用。
　　2.2 模型的解析与分析
　　2.2.1 缓冲液pH值、底物浓度效应分析 对二次回归模型采用“降维法”得出缓冲液的pH值和底物浓度对吸光度的效应方程。
　　yˆ 1 = 0.174 77 - 0.012 08 x1 - 0.007 66 x12（3）
　　yˆ 4 = 0.174 77 - 0.009 16 x42 （4）
　　吸光度与pH值及底物浓度的关系见图1。显示出当x1（缓冲液pH值）在低水平时，它和y成抛物线关系，在高水平时则几乎是一条负相关的直线，由图可知当x1约为-1时达最高点。x4（底物浓度）在0水平时，德国小蠊该酶的吸光度最大。
　　
　　2.2.2 水浴时间和反应温度效应分析 由模型（2）可知水浴时间和反应温度的交互作用对吸光度有一定影响，用“降维法”可得两者的交互效应方程：
　　yˆ 2，3 = 0.174 77+ 0.028 75 x2 + 0.025 58 x3 + 0.010 63 x2 x3（5）
　　不同水浴时间及不同反应温度下的吸光度值见表3。
　　
　　由表3可知，在所设计的水平内，随着水浴时间越长，反应温度越高，吸光度值呈直线上升。
　　2.3 试验模型的最优化方案分析

　　利用NLP过程求得本次试验设计水平内x1、x2、x3和x4的值分别为-0.79、2、2和0时，吸光度取最大值，即本次实验研究德国小蠊酸性磷酸酯酶测定的最佳条件为：在波长400 nm下，缓冲液pH 4.42，反应温度47℃，水浴时间50 min，底物浓度7.5×10-3 mol/L。
　　
　　3 讨论
　　二次回归通用旋转组合设计方法具有试验次数少、计算简便，可部分清除回归系数间的相关性等优点，并有助于克服回归正交设计中二次回归预测值的方差依赖于试验点在因子空间中位置的缺点［13］。本次实验研究表明，在德国小蠊酸性磷酸酯酶测定中，缓冲液的pH值、水浴时间、反应温度、底物浓度均对吸光度有明显影响。由模型分析得知，在所设计的水平内，醋酸缓冲液的pH值（x1）和底物浓度（x4）均与吸光度呈开口向下的抛物线关系，水浴时间（x2）、反应温度（x3）与吸光度呈明显正相关。水浴时间和反应温度是影响测定的关键因子，本次实验研究德国小蠊酸性磷酸酯酶测定的最佳条件为：在波长400 nm下，缓冲液pH 4.42，47 ℃水浴50 min，底物浓度为7.5×10-3 mol/L。
　　与郭凤英、邓新平［5，6］等所做的螨类酸性磷酸酯酶测定条件最优值（pH4.4 、42 ℃水浴40 min、底物浓度8.5×10-3 mol/ L）相比较，二者测定所获缓冲液的pH值都接近4.4，说明在酸性磷酸酯酶的反应测定中，pH的最佳值约为4.4。两者试验测定得到的最优底物浓度不同，可能与德国小蠊和螨类体内的酸性磷酸酯酶的活性不同有关。其次，本次试验设定的温度范围较窄，在设定实验温度范围内反应温度与吸光度呈正相关。然而，在实践中反应温度过高会导致酶变性，所以，关于温度对吸光度的影响趋势还有待扩大温度范围进一步研究。
　　（致谢：衷心感谢东南大学医学院公共卫生学院统计教研室闵捷副教授提供的统计学指导。）
　　
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　　（收稿日期：2006-07-21）
　　（英文编辑：黄建权；校对：丁瑾瑜）
　　“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文”。

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