百合致病病毒及脱毒技术研究进展

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　　摘要    百合病毒病是当前制约百合产业发展的主要瓶颈之一，深入了解百合病毒的种类和致病的作用机制，可为百合感病种球的早发现、快速检测以及百合无毒种球筛选提供支持。本文介绍了常见的百合致病病毒种类、病毒检测技术以及脱毒技术等方面的研究进展，并根据研究结果对开发无毒百合种球的新型筛选和检测技术进行展望，以期为促进百合产业健康快速发展提供参考。
　　关键词    百合致病病毒;病毒检测技术;脱毒技术
　　中图分类号    S436.8        文献标识码    A
　　文章编号   1007-5739（2019）24-0098-04                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）
　　Abstract    Lily virus disease is one of the main bottlenecks restricting the development of lily industry.In-depth understanding of the type of lily virus and the action mechanism of the disease can provide support for the early detection，rapid detection of susceptible lily disease bulbs and the screening of lily-free toxic bulbs.This paper introduced the research progress of common lily pathogenic virus species，virus detection technology and detoxification technology and so on.According to the research results，the new screening and detection technologies for the development of non-toxic lily bulbs were prospected，in order to provide reference for promoting the healthy and rapid development of lily industry.
　　Key words    lily pathogenic virus;virus detection technology;detoxification technology
　　百合属于单子叶植物，是百合科百合属多年生草本球根类植物，其繁殖方式为无性繁殖和有性繁殖，原产于中国，喜凉爽，较耐寒，在高温地区则生长不良，现主要分布于亚洲东部、欧洲、北美洲等北半球温带地区，国内则主产于湖南、河南、四川、浙江和江苏等地。在全球范围内已发现至少120个品种，其中有55个品种产于中国，百合鳞茎的淀粉含量丰富，具有极高的食用价值和药用价值;此外，由于百合花色种类丰富、花型和植株极具特色，也具有重要的观赏价值。20世纪40年代，百合病毒被发现，至今已成为危害百合种球生产和鲜切花品质的世界性危害[1]。多年来，对于百合病毒的研究一直停留在病原学、病害流行学和病毒检测技术的层面上。然而，近年来随着分子生物技术的不断发展，对植物病毒的研究也进入到分子水平，运用了分子生物学、基因工程和生物信息学等手段，并取得了一定的成果。Cohen等[2]首次利用农杆菌介导法转化百合，是百合抗病毒由脱毒组培技术向基因工程發展的转折点。目前，在全球范围内已有超过15种不同的病毒被报道[3-4]。本文对常见的百合病毒进行了系统介绍。
　　1    百合常见病毒
　　1.1    百合斑驳病毒（LMoV）
　　LMoV病毒是一个宽11～15 nm、长680～900 nm的弯曲、无包膜、棒状结构[5]，为危害百合种球质量的主要病毒之一，属于马铃薯Y病毒属的Potyvirus成员[6]。感染了LMoV病毒的百合植株会有叶片斑驳的现象，深绿色和浅绿色互相镶嵌出现于叶片上，有时还会出现红褐色坏死斑，感染植株的叶片会萎黄、卷曲和变窄，导致花变形甚至不开放[6-8]。这些症状可能非常轻微或在植物早期生长阶段无法被发现。
　　1.2    百合无症病毒（LSV）
　　LSV病毒是一个长度为640 nm、直径为17～18 nm的丝状粒子结构[5]。单独感染了LSV病毒的百合植株并无明显的患病症状[9]，寄主一般表现为隐症状[10]，但连续栽种患病球根会导致百合种球退化，从而造成感染植株只有较短的生长周期;产生的花粉粒较小，在严重情况下花蕾畸形或不开花[11];鳞茎逐年变小，球茎的产量明显降低。如与其他病毒共同感染时，叶片出现坏死斑、畸形、叶脉突出等症状[10]。在我国江南、江北均有发现，尤其以厦门的感染情况最严重。 　　1.3    黄瓜花叶病毒（CMV）
　　CMV病毒是寄主范围最广泛的植物病毒，它可以感染超过1 000种植物[5]。CMV病毒一般为潜隐性侵染[12]，常常与LSV病毒一起对百合植株进行复合感染。感染植株一般表现为叶片褪绿或叶脉黄化，花出现褐色斑点，叶片皱缩甚至畸形，植株矮小。主要分布于中国台湾、德国、英国、爱尔兰、瑞典、俄罗斯、日本、韩国、印度等多个国家和地区。
　　1.4    南芥菜花叶病毒 （ArMV）
　　在自然环境下，该病毒主要通过汁液摩擦接种以及种苗、块茎等无性繁殖材料进行传播，也可以通过介体线虫传播，并且传播范围广，现已报道的可侵染植物约有174属215种[13]。感染植株一般表现为百合花和叶褪绿及黄化，叶片皱缩甚至坏死，植株矮小。主要分布于加拿大、美国、日本、欧洲地区、南非、澳大利亚和新西兰等国家和地区，是我国重要的进境植物检疫性有害生物之一[14]。
　　1.5    草莓潜隐环斑病毒（SLRSV）
　　SLRSV能侵染种子、种球、块茎和苗木等，还可随无性繁殖材料的贸易进行远距离传播。在一些感病植株上，可引起叶片斑驳症状，导致品种生长衰退和百合球茎品质、产量严重损失。我国目前尚未见其发生危害的记录，同时也是我国对外检疫性有害生物之一[15]。
　　2    病毒检测技术
　　随着生物技术的不断发展，检测致病病毒的手段也在不断增加和创新，目前主要有生物学检测法、电子显微镜检测法、血清学检测方法、分子生物学检测方法四大类病毒检测技术[16]。
　　2.1    生物学检测法
　　生物学检测法又称为指示植物检测法。每一种植物病毒都有其特定的指示植物或鉴别寄主，在感染了某一种病毒后，指示植物或鉴别寄主就会出现特定的感染症状。根据这一特性，通过人为的摩擦接种，把含有待测病毒的汁液涂抹至指示植物或鉴别植物上，观察植株产生的病症，可以初步判断出病毒种类[17]。生物学检测法具有操作简便、不需要贵重的设备和仪器、成本较低、试验结果的直观性高等特点。但该方法耗时较长，易受气候变化、毒虫体传染等外界环境的影响，从而导致试验结果出现偏差。在培养指示植物时需要提供相同的生活条件以保证有相同的长势，需要较大的工作量，而且有时还会出现“一病多症”和“一症多病”[18]的现象。因此，该方法在目前的检测中应用较少。
　　2.2    电子显微镜检测法
　　自1939年Kausche首次利用电子显微镜观察到烟草花叶病毒的长形病毒粒子以来，电子显微镜检测法进入到植物病毒技术领域。通过电子显微镜能够观察到植物病毒的形态结构、大小及病毒的增殖，从而鉴定出病毒种类。常用的试验方法有超薄切片法、负染色电镜法、免疫电镜技术和胶体金免疫电镜等[19]。电镜检测法的观测结果直观、准确、灵敏性高，但由于试验仪器和设备昂贵，制片步骤和操作技术复杂，对试验人员的技术水平要求较高，故未能广泛应用于植物病毒检测中。
　　2.3    血清学检测方法
　　血清学检测法的原理是根据抗原和抗体特异性结合反应来判断病毒种类，利用该方法检测植物病毒具有高效、灵敏、直观等优点，但是检测结果与抗血清品质有着很大的联系，且没有办法检测类病毒或结构易变的病毒。血清学检测法主要包括了酶联免疫吸附法（ELISA）、组织印记法（TBI-A）、圆点免疫结合法（DBIA）。
　　2.3.1    酶联免疫吸附法（ELISA）。酶联免疫吸附法是指将抗原或抗体固定在酶联板，抗原或抗体与某种酶连接，两者结合形成抗原抗体复合体[16]，加入酶反应的底物后在酶联板上产生有色产物，根据颜色反应的深浅可以进行定性或定量分析。其是最常用的一种植物病毒检测方法。
　　2.3.2    圆点免疫结合法（dot-immunoBinding assay，dBIA）。该方法是对ELISA检测法的改进，以硝酸纤维素膜代替酶联板[19]。DBIA检测法保持了ELISA检测法的灵敏性和特异性，还减少了待检样品的用量，反应结果更加直观明显，使检测更加简便、高速和经济。
　　2.3.3    组织印记法（tissue blot-ELISA，TBIA）。TBIA检测法的原理和ELISA检测法相似且检测结果具有相同的可靠性。TBIA检测法中用硝酸纤维素膜和尼龙膜代替了酶联板[16]，比ELISA检测法具有更高的效率、灵敏度、方便性和更低的成本等特点。
　　2.3.4    增强发光酶免疫技术（enhanced luminescence enzyme immunoassay，ELEIA）。ELEIA检测法是将具有高灵敏度的化学发光检测技术与高特异性的免疫反应相结合的一项综合技术。与ELISA检测法相比，ELEIA检测法是以电信号的变化来代替酶催化底物的产物颜色变化，检测灵敏度较高，检测对象的范围更宽，但缺点是在临床检测中容易受到一些电化学活性物质的干扰和影响。
　　2.3.5    免疫荧光技术。免疫荧光技术由荧光抗体技术和荧光抗原技术组成[16]，依据的原理为抗原抗体特异性结合。该技术应用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体，试验中常用的荧光素为异硫氰酸荧光素（FITC）和四乙基罗丹明（BRZOO），在紫外光的照射下可观察到发出的荧光，这样便可检测出病毒种类及其在植株体内分布的情况[18]。此检测方法的优点是方法简便、特异性高。非特异性荧光染色少，缺点是敏感性偏低，而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
　　2.3.6    免疫膠体金技术。胶体金又称为金溶胶，是金盐在还原剂（如柠檬酸三钠）的作用下还原成金后所形成的大小均匀的金颗粒悬浮液，在静电作用下形成了稳定的胶体状态，是一种应用于抗原抗体的新型免疫标记技术[20]，分为免疫层析法和快速免疫金渗滤法，将胶体金作为示踪标志物，可用于高通量检测的双重或多重标记。该检测方法具有简单、快速、准确、无污染和无特殊仪器设备的需求等优点，适合田间快速诊断与口岸检疫[21]。 　　2.4    分子生物學检测方法
　　2.4.1    核酸分子杂交技术。依据核苷酸单链互补原理，用放射性同位素或非放射性地高辛等标记病毒，制作成DNA探针或RNA探针[18]，再将探针与待测样品植物的核酸杂交。如2条核苷酸链成功互补则杂交双链就会带有放射性，从而检测出病毒种类。此检测方法的缺点是放射性同位素对环境会造成污染[16]。
　　2.4.2    双链RNA电泳技术。在大多数植物中，RNA以单链的形式存在，只有在感染了病毒的情况下才会复制产生ssRNA的特异复制中间型dsRNA[22]，即双链RNA。因此，通过分离和分析dsRNA的存在[23]，可以推断出植株是否感染了RNA病毒或类病毒。此检测方法操作简便，所需的设备仪器较常见，一般实验室都可采用该检测方法。
　　2.4.3    聚合酶链式反应技术。①PCR和逆转录PCR。PCR反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。PCR技术的原理类似于DNA的天然复制过程，由高温变性、低温退火和中温延伸3个步骤构成。但由于大多数植物病毒为RNA病毒，因而在PCR之前需要进行逆转录PCR，将植物的mRNA逆转录为cDNA[24]，然后才能进行常规PCR技术。此检测方法有着灵敏度高、准确度高的特点。②实时荧光定量PCR技术。实时荧光定量PCR 是一种在DNA扩增反应体系中加入荧光基团[25]，以荧光化学物质检测每次PCR循环后产物总量的方法，结合了荧光检测和逆转录PCR 2种技术。该技术通过内参或外参法对待测样品中的特定 DNA序列进行定量分析，实现了从常规PCR技术的定性检测到定量检测的跨越。因为qRT-PCR技术的检测结果可能会受到样本的影响，所以需选择稳定表达的内参基因，以保证结果的准确性。此方法检测时间比常规PCR更短，需要的靶基因浓度更小。虽然该方法的仪器设备昂贵，但因为不需要进行凝胶电泳，对环境的污染较小，所以实时荧光定量PCR技术已越来越多地被运用到植物病毒检测中。③巢式PCR。巢式PCR是一种变异的PCR，使用2对PCR引物扩增完整的片段。第1对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第2对引物称为巢式引物结合在第1次PCR产物内部，使第2次PCR扩增片段短于第1次扩增。因此，此检测方法可用于病毒含量低、靶基因不稳定和扩增产物少而不能进行电泳检查的感染植株[16]。④多重PCR。多重PCR，又称多重引物PCR或复合PCR，是在同一PCR反应体系里加上2对以上引物，同时扩增出多个模板或同一模板的多个不同核酸片段的PCR反应技术[19]，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。该检测方法的优点是高效，检测时间比ELISA检测法短，且灵敏度更高，具有更高的实际应用价值[26]。
　　2.4.4    核酸依赖性扩增检测技术。其是一种以RNA模板进行等温核酸扩增并能实时观测结果的检测方法[16]。依赖核酸序列的扩增技术，是一种扩增RNA的新技术，是由一对特异引物介导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。此检测方法不需依靠昂贵的设备仪器，可检测RNA病毒和类病毒，同时模板中的DNA在检测室并不会对待测样品RNA病毒有所干扰，有操作简单、特异性强、灵敏度高、不易被污染等优点。该法已被广泛运用于植物病毒检测中。
　　2.4.5    环介导等温扩增技术。LAMP法是针对靶基因上的6个区域设计4条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，109～1010的扩增可在15～60 min内完成，反应能产生大量扩增产物——焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在[27]。此检测方法对仪器设备的要求较低，具有操作简便、高效、高灵敏性和高特异性的特点，是一种适合现场应用的快速检测方法。
　　3    病毒脱毒技术
　　1962年Phillips最早开展百合脱毒研究，利用百合茎尖培养技术成功脱毒[28];1966年Mori和Hamaya采用茎尖脱毒技术成功培养出无毒百合植株[29];在国内，李进通过茎尖脱毒技术培养出宜兴百合脱毒组培苗[30]。
　　经过不同的检测技术检测出病毒类型后，需利用组织培养技术进行百合脱毒处理，筛选出适合工厂大批量生产的百合种球。先对获得的脱毒株系进行病毒检测，随后利用快速繁殖技术提高百合繁殖系数，为未来百合无毒种球的长期应用奠定了基础[31]。
　　3.1    愈伤组织培养
　　愈伤组织培养所依据的原理是愈伤组织内病毒的复制速度远慢于细胞的分裂增殖速度，又或在分裂过程中其中一些细胞突变获得了抗病能力[32]。将百合植株的茎尖或鳞叶等外植体诱导成愈伤组织，进而培养成无毒试管苗，最后培育成完整的再生植株。但此方法的脱毒率为31.7%～46.7%，总体脱毒率偏低[33];此外，在愈伤组织长期无性繁殖培育过程中受到很多外界因素的刺激和影响，容易发生体细胞无性系变异，这种变异是不定向的，而无性繁殖的植物需保持优良性状，因而暂时不适合作为有效的脱毒途径[33]。该方法具有可行性高、试验周期较短、一次性成苗数较多的优点，在今后仍有研究和发展的价值和空间。
　　3.2    茎尖培养
　　茎尖培养所依据的原理是病毒在植株体内的不均匀分布，较老的组织和器官中病毒含量高，未成熟或幼嫩的组织和器官中病毒含量低，茎尖组织则为较幼嫩的部分[34]。因为病毒在植物体内依靠维管束进行转移，而茎尖分生组织没有维管束，所以只能通过胞间连丝进行转移，且病毒的转移速度比细胞分裂和组织生长的速度慢[35]，因而茎尖一般只含有微量或不含有病毒。因此，植物茎尖的无毒生长点培养成为了脱毒复壮的一个重要方法。 　　3.3    珠芽培养
　　珠芽培养是将百合的外部鳞片剥去，留下带有叶原基的珠芽生长点[34]，用无菌水冲洗数次后再剥去部分叶原基余下1～2个生长点[35]，将其切成小段后进行离体培养，经过脱分化成愈伤组织再分化，可以培养出成功脱毒的百合幼苗植株。
　　3.4    化学处理
　　在外植体培养过程中加入病毒抑制剂[36]，抑制病毒的合成、增殖和移动[37]，来达到脱毒的目的，常使用孔雀绿、硫尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、病毒唑等抗病毒药剂[37]。同时，在百合生产中可用植物油、矿物油、杀虫剂和外激素喷洒以控制百合病毒在植株间的蔓延，也可以用矿物油和拟除虫菊酯杀虫剂混合物喷洒植株，控制通过百合蚜虫传播的LMoV和LSV[35]。但是，在百合脱毒技术中较少单独运用化学处理，一般与茎尖培养技术结合进行脱毒，这样可使植株有更高的存活率和脱毒率[34]。
　　3.5    热处理
　　熱处理的原理是在高温条件下病毒会钝化，其繁殖速度明显减弱甚至不进行复制繁殖，在寄主体内的传播变慢或停止传播[34]。将植物在高温条件下进行培育，其嫩梢不含有病毒，且植物的脱毒率和存活率与培养温度的高低和时长有密切关系[38]。
　　3.6    超低温疗法
　　研究发现，植物在超低温条件下保存，其植株体内的病毒含量会明显降低，甚至部分材料不含病毒。此方法所依据的原理是含有病毒的顶端细胞中含有大量水分，在超低温（-80 ℃以下）的情况下胞内水分变成结晶水从而致死，但分生组织的细胞含水量少，细胞质浓，在超低温情况下不易致死[32]，可将经超低温处理过的茎尖进行增殖培养，故该方法可作为植物脱毒的一项技术。现有研究表明，经过1 h超低温处理的百合茎尖所培育出的新苗脱毒率超过90%[39]。超低温疗法脱毒技术的特点是操作简便、高效、可行性高、脱毒率高。
　　使用单一的脱毒技术处理百合植株难以完全脱除病毒，使脱毒率较低。2种或3种技术相结合可使脱毒率显著提升，脱毒技术综合处理成为了百合无毒化生产的首选[40]。
　　4    展望
　　随着科技的发展和创新，植物病毒病检测技术正在逐渐进入分子层面，并且朝着快速、高敏感性、高特异性和高通量并行性及自动化的方向发展[18]，使无毒种球能在早期被快速鉴定，但是该技术与美国、荷兰和日本等百合鲜切花技术发展较先进的国家相比仍存在差距。在百合种植时缺乏有效、系统和严格的植株病毒检疫控制，导致在经过多代单性繁殖后植物体内逐渐积累病毒，百合出现患病症状并在植株间蔓延，严重影响了百合种植及产业的发展[41]。
　　根据当今百合种植业的需求，超低温疗法是百合脱毒技术中较优先的选择，该技术不依靠昂贵的设备和复杂的技术，能够高效、简便地培养出百合脱毒种球。探索出最适的处理温度是目前的一个研究方向，同时如何做到利用分子层面的病毒检测技术在早期将无毒种球准确地鉴定出来也是科研工作者需要发展和完善的问题。
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