平菇菌糠中多糖提取及超氧化物歧化酶检测研究

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　　摘要：利用平菇菌糠为原料，通过单因素试验分析，对提取多糖的条件进行优化，得到最佳提取条件为温度100 ℃，浸泡时间0.5 h，提取时间1.5 h，料液比1∶15，此时菌糠中多糖提取率最高;在此条件下提取，平菇菌糠中的的多糖含量为5.48%;利用清除羟基自由基法对菌糠多糖进行抗氧化性研究，结果显示平菇菌糠在多糖浓度0.1 g/L时清除羟基自由基效果为17.77%，与同等浓度下维生素C的抗氧化性相差不大。通过热变性、丙酮沉淀的方法对平菇菌糠中的SOD提取及其含量测定进行研究，再利用邻苯三酚自氧化法测定SOD的活性，发现平菇菌糠中SOD含量为25.119 μg，酶活为22.28 U/mL。
　　关键词：平菇菌糠;多糖;SOD
　　中图分类号：F326.5         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）24-0194-03
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.047           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Extraction of polysaccharide from mushroom chaff of
　　Pleurotus ostreatus and detection of SOD enzyme
　　JIANG Ming，HOU An-ni，BI Ming-yu
　　（College of Life Science and Technology，Mudanjiang Normal University，Mudanjiang 157012，Heilongjiang，China）
　　Abstract： Using Pleurotus ostreatus fungus bran as raw material， the conditions for extracting polysaccharides were optimized through single-factor test analysis. The optimal extraction conditions were temperature 100 ℃， soaking time 0.5 h， extraction time 1.5 h， and the ratio of material to liquid was 1∶15， under which the extraction rate of polysaccharides from fungus bran was the highest; and the polysaccharide content in the P. ostreatus bran was 5.48%. The hydroxyl radical scavenging method was used to compare the antioxidant activity of the fungus bran polysaccharides. The results showed that when the polysaccharide concentration was 0.1 g/L， the effect of scavenging hydroxyl radicals was 17.77%， not much different from the antioxidant properties of vitamin C at the same concentration. The method of thermal denaturation and acetone precipitation was used to study the extraction and determination of SOD in P. ostreatus fungus bran， then the pyrogenic auto-oxidation method was used to determine the activity of SOD. It was found that the content of SOD in P. ostreatus fungus bran was 25.119 μg， and the enzyme activity was 22.28 U/mL.
　　Key words： Pleurotus ostreatus fungus bran; polysaccharide; SOD
　　菌糠是以木屑、秸稈等为原料，培养食用菌后剩下的固体培养基，是食用菌的菌丝残余及其代谢产物[1]。中国是食用菌大国，每年产生的菌糠废弃物数量庞大，大部分的食用菌菌糠废弃物会被当作垃圾随意丢弃或者焚烧，只有少部分还田或者重新用于栽培，既造成环境污染也造成资源浪费。菌糠含有多种营养物质，比如氨基酸、大量元素、木质素、纤维素、菌体多糖、粗蛋白等，若将废弃的菌糠再次利用，既可以为食用菌生产提供降低成本提高效益的新途径，又可以减少环境污染，是一举两得的良好举措[2-5]。本试验对平菇菌糠中多糖及超氧化物歧化酶（SOD）进行提取和检测研究，从而为食用菌菌糠再次利用提供一定的理论依据。
　　1  材料与方法
　　1.1  试验材料
　　平菇菌糠由牡丹江师范学院提供，从中挑选菌丝白密、料块结实的菌糠块，切除霉变和腐烂的部分，然后将其晒干，压碎备用。灵芝培养料原始配方：木屑78%，麸皮20%，蔗糖1%，石膏1%。
　　1.2  试验方法 　　1.2.1  菌糠的处理  将从食用菌培养室取得的食用菌菌糠袋拆开，将菌糠放在托盘上，于烘干箱内进行烘干，80 ℃下烘干24 h，期间不断翻动菌糠，避免将菌糠烤糊，将菌糠磨粉。
　　1.2.2  多糖提取条件优化  采取水提醇沉的方式提取平菇菌糠多糖，将平菇菌糠用去离子水浸泡后，控制温度进行熬煮，静置放凉，用4层纱布过滤后利用旋转蒸发仪进行浓缩，得到提取液。按提取液与无水乙醇1∶3的比例进行醇沉，醇沉时间为48 h（期间放入冰箱冷藏）。取出醇沉好的提取液，抽滤，去掉多余水分以及乙醇，并对滤渣进行烘干处理（烘干箱温度85 ℃），记录烘干后多糖的质量。
　　选取提取温度（A）、浸泡时间（B）、提取时间（C）、料液比（D）4个因素，以粗多糖的提取率为指标，确定最佳提取条件。水平因素见表1。
　　1.2.3  粗多糖的提取  按照正交试验测定的最佳提取方案，取平菇菌糠研磨粉200 g，平均分成4份进行粗多糖提取。提取步骤见“1.2.2”。
　　1.2.4  多糖抗氧化性作用  取4支具塞试管，分别标记a、b、c、d。a.取1 mL浓度0.09%的水杨酸乙醇溶液，1 mL 0.1%浓度的HCl乙醇溶液，加入到10 mL定容瓶中定容，摇匀，向其中加入1 mL 0.06%浓度的FeSO4溶液，混匀。b.在a的基础上加入1 mL 0.02% H2O2溶液。37 ℃反应10 min，以去离子水为参比，510 nm处测定吸光度，记吸光度为A0。c.在a的基础上加入1 mL不同浓度的多糖溶液。510 nm处测定吸光度，记吸光度为A1。d.在a的基础上加入1 mL不同浓度的多糖（或维生素C）溶液，再加入1 mL 0.02% H2O2溶液，摇匀。37 ℃反应10 min，510 nm处测定吸光度，记吸光度为A2。
　　羟基自由基清除率=[A0-（A2-A1）]/A0×100%
　　1.2.5  粗酶液的提取  称取平菇干菌糠5 g，加水煮沸，3层纱布过滤，反复3次，收集得到粗酶液。
　　1.2.6  粗酶液的处理  热变性：分别取一定体积的粗酶液，放入65 ℃的水浴锅内保温10 min，然后迅速冷却到室温，3 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min，弃去沉淀物，收集上清液。
　　丙酮沉淀：取一定体积的粗酶液置于冰浴中冷却，然后在-5 ℃以下温度操作，缓慢加入1.5倍预冷的丙酮，边加边搅拌均匀，静置2～3 min，待其自然沉淀后，4 000 r/min、4 ℃离心5 min，弃去上清液得到沉淀。用少量去离子水溶解沉淀，4 000 r/min、4 ℃离心5 min后即得到粗SOD酶液。
　　1.2.7  标准曲线的制作及SOD含量的测定  取6支10 mL具塞试管，在试管中精确吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL标准蛋白溶液，定容至1 mL，加入5 mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，并在室温下放置5 min后于595 nm处测定吸光度，以标准蛋白质含量为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线（表2）。
　　试验中，使用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量，称取0.1 g样品提取液，再加入0.9 mL去离子水，加入5 mL考马斯亮蓝G-250混匀放置2 min后，以标准曲线作对比，测定595 nm波長处的吸光度。
　　1.2.8  SOD酶活力的测定[6]
　　1）邻苯三酚自氧化速率的测定。取两支试管，根据表3先加入25 ℃预热过的缓冲液，然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用50 mmol/L Tris-HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倒入比色杯中，测量325 nm波长处的吸光度，每隔30 s读取一次，测定4 min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增加或减少加入的邻苯三酚的量以控制光吸收值）。
　　2）SOD样品的活性测定。样品管替代自氧化管。当测定样品管时，首先加入预热的SOD酶液，然后加入邻苯三酚。其余步骤与邻苯三酚自氧化速率的测定相同（表4）。
　　3）样品酶活性的计算。在25 ℃、pH 8，波长为325 nm的1 mL反应液中，1 min抑制邻苯三酚自氧化速率为50%的酶量定义为1个酶单位。
　　样品酶活性（U/mL）=[（0.070-△A325）×100%×V总]/（0.070×50%×V0×Vs）
　　式中，△A325表示反应吸光值变化值，V总表示反应总体积，Vs表示加入样品液的体积，V0表示活力单位定义体积（1 mL）。
　　2  结果与分析
　　2.1  正交试验结果分析
　　在单因素试验的基础上对影响多糖提取较显著的因素进行正交试验，结果见表5。表5数据显示，菌糠多糖的最佳提取方案为试验7号，即菌糠多糖最佳提取条件为温度100 ℃，浸泡时间0.5 h，提取时间1.5 h，料液比1∶15，此时菌糠中多糖提取率最高。
　　2.2  平菇菌糠多糖含量及抗氧化性试验结果
　　在菌糠多糖最佳提取条件即温度100 ℃，浸泡时间0.5 h，提取时间1.5 h，料液比1∶15时，提取菌糠多糖并进行抗氧化性比较（表6、表7）。
　　2.3  平菇菌糠SOD提取结果
　　由表3测得的OD值得出标准曲线为y=0.005 6x，R2=0.995，平菇菌糠SOD含量平均值为25.119 μg，平菇菌糠的SOD酶活为22.28 U/mL。
　　3  讨论与结论
　　食用菌多糖可以控制细胞分裂分化、调节细胞生长和衰老，具有抗病毒，抗肿瘤的功效[7]。超氧化物歧化酶是具有催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，平衡机体内氧自由基功能的抗氧化酶，具有抗衰老、抗氧化、防晒等重要作用[8]。菌糠是食用菌培养料出菇后残留的废弃料，其中含有较多的纤维素、木质素、丰富的菌丝残体蛋白和菌丝体的次生代谢产物以及作物生长所必需的氮、磷、钾等大量元素，硫、钙、铜、锌等中量元素和微量元素。通过试验发现，平菇菌糠中可以提取出多糖及超氧化物歧化酶，这将为食用菌菌糠的再次利用提供一定依据。
　　参考文献：
　　[1] 晏家友，张  纯，张锦秀，等.菌糠的营养价值及其应用概况[J].饲料博览，2010（11）：41-43.
　　[2] 陈  明，王  晨，程  薇，等.中国食用菌[J].食用菌菌糠加工技术研究，2015，34（2）：1-4.
　　[3] 姜  明，潘永明，李  川，等.牡丹江地区食用菌菌糠在生态农业中的综合利用及前景展望[J].黑龙江科技信息，2016（36）：55-56.
　　[4] 赵晓丽，陈智毅，刘学铭.菌糠的高效利用研究进展[J].中国食用菌，2012，31（2）：1-3.
　　[5] 马寿福，军  花，刁治民，等.食用菌菌糠营养价值及利用途径的研究[J].青海草业，2006，15（3）：36-40.
　　[6] 俞建瑛，姜  瑜，王善利.生物化学实验技术[M].北京：化学工业出版社，2005.
　　[7] 叶忠春，梁  智.食用菌多糖综述[J].轻工科技，2012（10）：16-18.
　　[8] 赵倩芸，张  娜，杨  豆，等.超氧化物歧化酶在化妆品中应用的研究进展[J].中国洗涤用品工业，2016（12）：70-73.
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