高效液相色谱法检测菜豆中阿维菌素残留量

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　　摘要    本文建立了反相高效液相色譜法测定菜豆中阿维菌素残留量的方法，即以乙酸乙酯为提取剂，液液萃取净化，经N-甲基咪唑和三氟醋酸酐衍生化，采用高效液相色谱法-荧光检测器（激发波长365 nm，发射波长470 nm）进行测定。同时，为了确定1%阿维菌素水乳剂在菜豆中的施用安全性，通过2年两地田间试验和样品室内检测试验，研究了其在菜豆上的消解动态及最终残留量。结果表明，在0.050～5.000 μg/mL浓度范围内，阿维菌素的浓度与峰面积线性关系良好，线性相关系数γ=0.999 3。添加浓度在0.004 4～0.440 0 mg/kg时，方法的平均回收率为94.35%～99.42%，相对标准偏差为4.81%～5.84%;以1%阿维菌素水乳剂0.45 g/m2喷药，阿维菌素在菜豆上的消解半衰期为1.4～1.7 d;施药7 d后采集的菜豆样品中阿维菌素含量均低于MRL值0.05 mg/kg。本方法简便、快速、准确，适用于阿维菌素在菜豆上的残留量测定。
　　关键词    阿维菌素;菜豆;残留;消解动态;高效液相色谱法
　　中图分类号    S481+.8        文献标识码    A
　　文章编号   1007-5739（2020）06-0106-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）
　　Determination  of  Abamectin  Residue  in  Kidney  Bean  by  HPLC
　　ZHANG Ru-ling 1    AN Feng-ying 1    HU De-yu 2 *    ZHANG Yu-ping 2    ZHANG Kan-kan 2    LU Ping 2
　　（1 Tongren Vocational and Technical College，Tongren Guizhou 554300; 2 Research and Development Cnter for Fine Chemicals，Guizhou University）
　　Abstract    A reversed-phase HPLC method for the determination of avermectin residues in kidney bean was established.The avermectin residues in kidney bean were extracted and purified by liquid-liquid extraction with ethyl acetate as the extractant.After derivatization with N-methylimidazole and trifluoroacetic anhydride，the avermectin residues in kidney bean were determined by HPLC with fluorescence detector（excitation wavelength was 365 nm and emission wavelength was 470 nm）.At the same time，the digestion dynamics and the final residue of abamectin water emulsion in kidney bean were studied through two years of two fields test and sample laboratory test，in order to determine the application safety of 1% abamectin water emulsion in kidney bean.The results showed that in the range of 0.050-5.000 μg/mL，the linear relationship between avermectin concentration and peak area was good，and the linear correlation coefficient was 0.999 3.When the concentration was 0.004 4-0.440 0 mg/kg，the average recovery of the method was 94.35%-99.42%，and the relative standard deviation was 4.81%-5.84%.When the 1% abamectin water emulsion was 0.45 g/m2，the half-life of abamectin digestion on kidney bean was 1.4-1.7 d.The content of abamectin in kidney bean samples collected after 7 days was lower than that of MRL 0.05 mg/kg.This method is simple，rapid and accurate.It is suitable for the determination of avermectin residue in kidney bean. 　　Key words    abamectin;kidney bean;residue;digestion dynamic;HPLC
　　阿维菌素是一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元环内酯双糖类化合物，是经过微生物发酵、提取的新型抗生素类杀虫杀螨剂[1-7]，对多种作物的害虫和螨类具有触杀和胃毒作用，同时具有微弱的熏蒸作用，无内吸作用[8-10]，具有广谱、高效、低残留等特点，不易对土壤各种微生物和各种酶产生较大危害[11]，是当前农业害虫综合防治中理想的生物农药[12]。
　　关于阿维菌素的检测方法国内外有大量报道，张少华等[13]建立了以乙腈为提取溶剂，测定葱中阿维菌素残留。赵领军等[14]通过乙腈匀质提取测定冬枣中阿维菌素残留量。张红艳等[15]采用了甲醇振荡提取，二氯甲烷萃取净化，测定黄瓜和梨中阿维菌素残留。王晓菁等[16]采用酸性乙腈溶液提取，建立了高效液相色谱法分析枸杞中阿维菌素残留量的方法。刘金凤等[17]采用样品中加入盐酸溶液、丙酮，振荡提取，测定土壤中阿维菌素残留量。
　　阿维菌素可用于防治菜豆上的美洲斑潜蝇，但其在菜豆上的残留检测未见报道。本文结合文献中阿维菌素提取、检测方法，在建立菜豆中阿维菌素残留分析方法的基础上，研究了1%阿维菌素水乳劑在菜豆中的消解动态，得到此农药在菜豆上的消解半衰期，为其在菜豆上的合理施用提供参考依据。
　　1    材料与方法
　　1.1    仪器与试剂
　　高效液相色谱：Agilent 1100;艾柯超纯水机：AKJY-10（台湾艾柯，成都唐氏康宁科技发展有限公司）;旋转蒸发仪：BU
　　CHI R-210（瑞士BUCHI公司）。
　　阿维菌素标样（纯度≥99.4%，北京北化恒信生物技术有限公司）;甲醇（色谱纯）;乙酸乙酯（分析纯）;无水乙醇（分析纯）;饱和氯化钠水溶液;超纯水;无水硫酸钠（分析纯，550 ℃烘烤5 h，于干燥器中保存备用）;硅藻土（Celite 545）;乙腈（分析纯）;三氟醋酸酐（分析纯）;N-甲基咪唑（分析纯）。
　　试验药剂：1%阿维菌素水乳剂;试验作物：菜豆，品种为双丰二号）。
　　1.2    试验设计
　　根据农药残留登记田间试验要求，进行了1%阿维菌素水乳剂在菜豆上2年两地（贵州省贵阳市、北京市）田间试验，试验严格按照《田间试验设计标准操作规程》中的相关需求执行。
　　1.2.1    消解动态试验。试验设3个重复小区和1个空白对照，每个小区面积为30 m2左右，于菜豆生长至成熟个体一半大小时，以1%阿维菌素水乳剂按照推荐高剂量的1.5倍（0.450 g/m2）对菜豆植株喷雾施药1次后，按间隔2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d取样，采用五点取样法，每小区取菜豆2 kg，切碎，混匀，用四分法分取200～300 g，样品装于封口容器内，-20 ℃保存于冷库中，备用。
　　1.2.2    最终残留试验。试验设计同1.2.1，以0.225、0.338 g/m2 2个剂量分别设3次、4次喷药，施药间隔期7 d。距最后一次施药后1、3、5、7 d各取样1次，取样及样品处理方法同消解动态试验。
　　1.3    分析方法
　　1.3.1    提取净化。准确称取10.0 g菜豆，置于250 mL具塞三角瓶中，加入60 mL乙酸乙酯、25 mL二次水，混匀振荡提取1 h，静置10 min，在铺有Celite 545的砂芯漏斗中抽滤，滤渣再加入60 mL乙酸乙酯振荡提取1 h，抽滤，抽滤后用10 mL乙酸乙酯洗涤容器和残渣，合并滤液，然后转移至250 mL分液漏斗中，向其中加入20 mL饱和食盐水，萃取净化，收集上层有机相，无水硫酸钠干燥后收集至150 mL梨形瓶中，旋转蒸发仪浓缩（50 ℃）近干，待衍生化。
　　1.3.2    衍生化方法。将1.3.1中待衍生化样品，氮气流吹干，1 mL乙腈定容，向其中加入N-甲基咪唑和三氟醋酸酐各0.3 mL，黑暗处衍生化反应30 min，向其中加入1 mL无水甲醇，终止衍生化反应，黑暗处静止30 min，经0.45 μm有机膜过滤，待测。
　　1.3.3    色谱分析条件。检测器：荧光检测器，Ex=365 nm，Em=470 nm;色谱柱：S-Gel C18，5 μm（150×4.6 mm）流动相为甲醇-水（95∶5，V∶V），流速为1.0 mL/min;柱温为25 ℃;进样量10.0 μL。
　　2    结果与分析
　　2.1    色谱条件的优化
　　2.1.1    检测器的选择。阿维菌素的高效液相色谱分析方法中常采用紫外检测器和荧光检测器。本试验分别采用这2种检测器进行检测，结果发现，相同浓度的阿维菌素标准溶液在2种检测器检测出来的标样谱图对称性均好，基线也平稳，但紫外检测器上杂质峰稍多，在荧光检测器上阿维菌素响应值大，故本试验采用荧光检测器进行检测。
　　2.1.2    柱温的选择。柱温对固定相、流动相及待测组分在二者之间的分配都有重要的影响。本试验中，柱温在20～40 ℃时对分离度的影响不大，故选择25 ℃（柱温箱控制）。
　　2.1.3    流动相的选择。根据阿维菌素理化性质及所查阅的国内外相关文献，分别采用甲醇-水（98∶2，V∶V）、甲醇-水（96∶4，V∶V）、甲醇-水（95∶5，V/V）作为流动相，最终选择甲醇-水（95∶5，V/V）为流动相，此流动相比例下的色谱图峰宽适中、峰型对称、分离度好。 　　2.2    前处理条件的优化
　　根据相似相容原理，综合文献相关报道，本试验先后加入丙酮、甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯和二次水对菜豆中的阿维菌素进行提取。其中，用丙酮和甲醇振荡提取后，直接测定，回收率较低;而采用无水乙醇提取后用二氯甲烷萃取，以及先后加入乙酸乙酯、水进行振荡提取，二者的回收率均达到70%以上，考虑到前者使用的萃取剂二氯甲烷毒性较大且不够经济，故本试验选择后者作为提取剂。
　　2.3    标准曲线及回归方程
　　配制0.050、0.176、0.500、1.760、5.000 μg/mL质量浓度系列的标准溶液按本文1.3.2中所述方法衍生化后进行测定，以峰面积（A）对质量浓度（C）做线性回归（图1），得标准曲线方程A=68.582C-3.400 4，相关系数γ=0.999 3。阿维菌素在0.050～5.000 μg/mL的浓度范围与面积线性关系良好，能较好地达到外标法定量分析的目的。
　　2.4    方法的准确度及精密度
　　从表1、图2、图3、图4可以看出，菜豆添加质量分数为0.004 4～0.440 0 mg/kg的阿维菌素时，方法的平均回收率为94.35%～99.42%，相对标准偏差为4.81%～5.84%。方法的精密度和准确度较好，均符合农业部农药检定所农药残留试验准则的要求。
　　2.5    方法的灵敏度
　　在本文1.3.3已选择高效液相色谱条件下，阿维菌素的最小检出量为8.7×10-11 g;通过添加回收率试验，测得菜豆中阿维菌素的最低检出浓度为0.004 4 mg/kg。
　　2.6    消解动态试验结果
　　按上述试验方法对所采集的菜豆样品进行检测，得到 1%阿维菌素水乳剂在贵州省贵阳市、北京市菜豆中的消解动态数据，具体见表2、图5、图 6。
　　对试验结果进行回归分析，得到2009年、2010年贵阳市和北京市菜豆样品中阿维菌素消解动态方程，即C=0.452 2exp（-0.415 1 t）（贵阳市2009年）、C=0.515 6exp（-0.504 4 t）（贵阳市2010年）、C=0.361 6exp（-0.412 2 t）（北京市2009年）、C=0.474 8exp（-0.505 6 t）（北京市2010年），半衰期分别为1.7、1.4、1.7、1.4 d，相关系数（γ）分别为-0.917 1、-0.949 9、-0.931 3、-0.951 2。
　　3    结论
　　本文首次建立了菜豆中阿维菌素检测方法。采用乙酸乙酯、二次水对菜豆中阿维菌素进行振荡提取、液-液萃取净化的前处理方法毒性小、费用低，且阿维菌素色谱峰面积与质量浓度之间有较好的线性关系，方法的准确度、精密度等各项技术指标均符合中华人民共和国农业行业标准《农药残留试验准则》（NY/T 788—2004）中农药残留检测的基本要求，可有效适用于菜豆中阿维菌素残留的定量分析。以1%阿维菌素水乳剂0.450 g/m2推荐剂量施用，200倍稀释液均匀喷施，阿维菌素在供试两地的菜豆中消解半衰期为1.4～1.7 d，施药前3 d，阿维菌素降解速度很快，施药10、14 d后，菜豆中阿维菌素的残留量低于最低检出浓度0.004 4 mg/kg，小于推荐MRL值0.05 mg/kg[18]。
　　4    参考文献
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