高效液相色谱法测定咳喘停袋泡颗粒中黄芩苷的含量

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　　摘要：目的 采用高效液相色谱法测定咳喘停袋泡颗粒中黄芩苷的含量。方法 用薄层色谱法对其君药黄芩中的主要成分黄芩苷进行鉴别;以高效液相色谱法对黄芩苷进行定量分析，色谱柱为CAPCELL PAK-C18柱（4.6mmL×250mm，5μm），柱温30℃，以甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）为流动相，流速为1mL/min，检测波长为276nm.结果 薄层色谱无干扰，专属性强。 黄芩苷浓度在0.10048μg/mL～1.0048μg/mL范围内线性关系良好，得回归方程y=3471.6X-1.8909（r2=1），平均加样回收率为102.15%，RSD为0.129%（n=6）。 结论 所用方法简便、准确、重现性好，可用于咳喘停袋泡颗粒中黄芩苷的含量测定。
　　关键词：咳喘停袋泡颗粒;黄芩苷;高效液相色谱法;含量测定
　　中图分类号：R927.2 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2019）03-0074-04
　　咳喘停袋泡颗粒为玉溪市中医医院院内制剂，主要成分：金银花、连翘、黄芩、葶苈子、陈皮、甘草等。功能主治：清热化痰，肃肺止咳，用于痰热型急慢性支气管炎。据临床研究表明[1-3]：咳喘停袋泡颗粒广泛应用于临床，治疗慢性支气管、肺心病急性发作期、热哮型支气管哮喘、特发性肺间质纤维化等。黄芩为本方的主药之一，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效，黄芩苷是其主要有效成分。 为了保证服用咳喘停袋泡颗粒的安全性以及有效性，提高院内制剂的临床指导用药，本文将黄芩苷作为测定指标，对其进行薄层色谱鉴别，并采用HPLC法对其质量标准进行研究。
　　1 仪器与试药
　　仪器：1260型高效液相色谱仪（四元泵带真空脱气机、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、仪器控制及数据处理）;BSA224S-CW电子天平、BP211D-OCE电子天平;cpx5800H-C超声波清洗仪、PURELAB FLEX超纯水仪。
　　试药与试剂：黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110715-201720，含量为93.5%）;咳喘停袋泡颗粒（玉溪市中医医院制剂室）;硅胶GF254薄层板、聚酰胺薄膜（青岛海洋化工厂）;甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水。
　　2 方法选择与结果
　　2.1 定性鉴别[ 10] 取本品粉末 3.5g，加乙酸乙酯-甲醇（3：1）的混合溶液30 mL，加热回流30 min，放冷，濾过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，取上清液作为供试品溶液 。另取黄芩苷对照品加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述供试品溶液、对照品溶液各2 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置日光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
　　2.2 色谱条件 色谱柱：CAPCELL PAK-C18（4.6×250 mm，5 μm）;流动相：甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）;检测波长：276 nm;理论塔板数按黄芩苷峰计算不低于5000[8-9]。
　　2.3 测定波长确定 取对照品溶液，以70%乙醇溶液为空白对照，在紫外光200 nm～400 nm波长范围内进行扫描，黄芩苷对照品溶液在276 nm波长处有最大吸收，且无干扰。故选择276 nm为检测波长。
　　3 溶液的制备 [10]
　　3.1 对照品溶液的制备 （1）取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成0.1 μg/mL的对照品溶液。（2）取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成50 μg/mL的对照品溶液。
　　3.2 供试品的制备 取本品3.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理10 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL，置10 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
　　3.3 阴性对照溶液的制备 取缺黄芩的其他组分，按处方工艺制成阴性制剂，按“3.2”项下方法制成阴性对照溶液。
　　4 方法学考察
　　4.1 专属性试验 分别精密吸取3.1.1项下的对照品溶液、3.2项下的供试品溶液、3.3项下的阴性对照溶液各10μL进样，分别注入液相色谱仪，在2.2色谱条件下，样品中黄芩苷色谱峰与对照品黄芩苷色谱峰保留时间相近，阴性对照溶液在黄芩苷色谱峰相应位置上无色谱峰出现，证明无干扰。
　　4.2 线性范围考察 精密吸取3.1.2项下制备的黄芩苷对照品溶液，进样量分别为2、4、6、8、10、15、20 μL，注入色谱仪，以待测组分的质量为横坐标，峰面积A为纵坐标进行线性回归考察。得回归方程y=3471.6X-1.8909（r=1），结果表明黄芩苷在0.10048 μg/mL～1.0048 μg/mL范围内线性关系良好。
　　4.3 精密度试验 精密取3.1.1项下制备的同一对照品溶液10μL，连续进样6次，记录峰面积。结果样品溶液中黄芩苷峰面积的RSD为0.365%，说明精密度良好（n=6）。见表1。
　　4.4 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h分别进样，依照样品含量测定项下方法测定峰面积。结果24 h内RSD为 0.06%，说明咳喘停袋泡颗粒样品溶液在24 h内稳定性良好。见表2。 　　4.5 重复性试验 取同一批号的咳喘停袋泡颗粒样品，精密称取3.5 g，平行制备6份供试品溶液，每份进样3次，测定峰面积，RSD值为0.320%，表明重现性良好。见表3。
　　4.6 加样回收试验 精密称取样品0.3 g，共6份，按3.2项下的方法制备供试品溶液，分别精密加入3.1.2项下制备的浓度相同的黄芩苷对照品溶液3.27 mL，进样量10 μL，测得平均回收率为102.15%，RSD为0.129%。见表4。
　　5 样品含量测定
　　取3批咳喘停袋泡颗粒，按3.2项下方法制备供试品溶液，每份进样3次，每次取10 μL注入液相色谱仪进行测定，结果得咳喘停袋泡颗粒中黄芩苷的平均含量为5.45 mg/g。见表5。
　　6 实验结果
　　HPLC法测定咳喘停袋泡颗粒中黄芩苷含量的方法学考察结果表明，在276 nm检测波长下，以甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）为流动相，C18为固定相，该方法在線性范围内线性关系良好，重复性和稳定性良好。该方法简便、准确、重复性好，空白无干扰，可作为咳喘停袋泡颗粒中黄芩苷含量测定的定量方法，为医院制剂提供快速准确的测定方法。
　　7 讨论
　　7.1 供试品提取方法的考察 分别采用以70%甲醇为溶剂进行超声、以及用乙酸乙酯萃取和用甲醇加热回流对供试品进行提取，结果用70%甲醇做溶剂峰形良好，分离度好，有效成分含量相对较高，操作方便。
　　7.2 定性鉴别 采用不同的展开系统以及不同的薄层板对供试品中的黄芩苷进行鉴别，结果在以聚酰胺薄膜为薄层板，醋酸为展开剂，1%三氯化铁乙醇溶液为显色剂条件下，斑点显色清晰，效果相对较好，其Rf值为0.67。
　　7.3 测定波长的选择 采用紫外分光光度计对黄芩苷对照品进行扫描（400.0 nm-200.0 nm），在276nm处有最大吸收，故采用该波长作为检测波长。
　　7.4 色谱柱的选择 取同一供试品溶液，采用长度不同的色谱柱进行测定：150 mm和250 mm，结果采用长柱250 mm分离效果较好，峰面积稳定，保留时间相近。
　　参考文献：
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