卡其百合的不定芽诱导及植株再生

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　　摘要：采用卡其百合（Lillium spp. var. Khaki）的种球为外植体，以MS为基本培养基，添加不同浓度配比的植物生长调节剂，对外植体进行不定芽的诱导、生根及植株再生。对 6-BA、NAA、GA3、IBA及活性炭等成分的添加浓度及配比对卡其百合不定芽诱导及生根的影响进行了正交试验。结果表明，不定芽诱导的最佳培养基配方为MS培养基附加2.0 mg/L 6-BA、0.10 mg/L NAA和0.5 mg/L GA3，经验证其不定芽诱导率可达83.3%，芽较为粗壮，色嫩绿，褐化现象很少;不定芽生根的最佳培养基配方为1/2 MS附加0.1 mg/L NAA和0.1 mg/L IBA，经验证其生根率可达73.3%，每个不定芽生根数目较多，根较为粗壮，状态良好。
　　关键词：卡其百合;组织培养;植物生长调节剂;不定芽
　　中图分类号：Q813.1+2;S644.1         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2020）01-0149-03
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.034           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract： With the bulbs of Lillium spp. var. Khaki as explants， MS medium plus different concentrations of plant growth regulators were used to inducing adventitious shoots and roots for plant regeneration. In this process， orthogonal experimental methods were used to analysis the impact of the concentrations and proportions of 6-BA， NAA， GA， IBA and active carbon to shoots and roots inducement of Lillium spp. var. Khaki. The results showed that the optimal medium for shoots inducement was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3. After retesting， it was proved that the ratio of shoots inducement was 83.3% and the shoots were strong， fresh green and less browning. The optimal medium for rooting of adventitious shoots was 1/2MS+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA and the ratio of rooting was 73.3%. The number of roots for each adventitious shoot was higher. The roots were strong and in good condition.
　　Key words： Lillium spp. var. Khaki; tissue culture; plant growth regulator; adventitious shoot
　　百合是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium spp.）多年生球根花卉，其花朵硕大、花色丰富、花香宜人，具有较高的观赏价值，深受人们喜爱。目前记载百合种类全世界约115种，中国原产约55种[1，2]。自20世纪80年代，中国已开始研究观赏百合，然而高品质、高观赏价值的品种很少。国际上，以荷兰和美国为中心，已育出上千种栽培品种，几乎垄断了国际百合种球市场[2]。因此，百合的种质创新已成为中国百合花卉市场发展的重中之重。而植物组织培养技术被应用于百合新品种选育、优质种苗生产、种植资源创新和保存等诸多方面。
　　卡其百合（Lillium spp. var. Khaki）是近年来国际上培育出的较新的栽培品种，具有花期长、抗病性强、成活率高等特点。试验主要应用植物组织培养技术，建立卡其百合的快速繁殖体系，旨在为百合育种提供资料。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　供试材料为新鲜的卡其百合种球，武汉市花卉市场购买。
　　1.2  主要仪器设备
　　高压蒸气灭菌锅、超净工作台、光照恒温培养箱等。
　　1.3  方法
　　1.3.1  外植体的制备与接种  将百合种球用自来水冲洗30 min，去除种球外部鳞片，留中间茎尖部分，移至超净工作台内，75%乙醇消毒1 min，无菌水冲洗3遍，2%次氯酸钠溶液处理15 min，无菌水冲洗3遍，切取0.5～1.0 mm厚的薄片，接种到培养基中。
　　1.3.2  培养基配方与培养条件
　　1）不定芽诱导培养基。以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA、NAA和GA3，另加3%蔗糖、0.7%琼脂粉，pH 5.8～6.0。
　　2）生根培养基。1/2 MS附加不同浓度的NAA、IBA和活性炭，3%蔗糖、0.7%琼脂粉，pH 5.8～6.0。
　　3）培养条件。不定芽诱导期间，光照12 h/d，不定芽生根期间，光照16 h/d，其他条件均为25 ℃，光照度为1 000～2 000 lx。 　　1.3.3  炼苗与移栽  将根系发达、生长健壮的组培苗瓶子放置于自然光照和温度下24 h，之后开盖，室温、弱光照条件下放置2 d后小心将其取出，用清水洗净根系上的残余培养基，放入洁净小盘中自然阴干1～2 d，直到苗身稍微失水，再移栽于沙子﹕腐殖土为1∶1的混合基质中，浇适量水，约7 d 后长出新根再浇1次水，以后每 3 d浇水1次。注意炼苗期间防止阳光直射和基质过湿。
　　1.3.4  正交试验  确定影响百合不定芽诱导和生根的因素各3个，分别设定3个水平（表1、表2），进行L9（34）正交试验。
　　2  结果与分析
　　2.1  百合不定芽诱导正交试验结果
　　将百合种球茎尖外植体按照表1所示的正交设计进行试验，接种在不同激素浓度配比的不定芽诱导培养基中，每个试验接种30块外植体，培养5～7 d即可见外植体组织膨大，20 d左右开始有不定芽生成，40 d左右大量不定芽形成，此时，将诱导情况进行统计分析，结果如表3所示。从表3可以看出，6-BA对百合不定芽诱导的影响最大，极差（R）为24.33，随着6-BA浓度的增加，诱导出不定芽的外植体量有所增加。但当6-BA浓度增加时，褐化现象也随之增多，芽的数量虽多，却极易产生硬结，色暗，很难再生，且易褐化。
　　NAA的添加也是必不可少的，其极差（R）为16.33，随着浓度的增加，可有效促进不定芽的诱导，而与6-BA配合后，诱导效果更好，但随着NAA添加量的增加，有少量愈伤组织产生，因此其添加浓度不宜过高。
　　GA3的添加对百合不定芽的诱导量并无明显影响，其极差（R）最低，为7.67。然而，从芽的状态上看，GA3可改善不定芽的伸长生长，且色泽嫩绿，随着GA3浓度的提高，褐化现象也有所减少，因此，少量添加GA3对于不定芽的状态调整有一定的帮助。
　　综合不定芽诱导量及状态是否良好等因素，最佳的激素组合为2.0 mg/L 6-BA、0.10 mg/L NAA和0.5 mg/L GA3。经验证得到不定芽诱导率可达83.3%，芽较为粗壮，色嫩绿，褐化现象少（图1）。
　　2.2  百合不定芽生根正交试验结果
　　百合不定芽诱导50 d左右，选取状态良好的不定芽，切取下来接种在不定芽生根培养基中进行生根，每个试验接种30个不定芽，10 d左右即有根生成，20 d时统计数据进行分析，结果见表4。由表4可知，NAA的添加对百合不定芽生根的影响极差（R）为42.20，为3个因素中最大的，随着NAA浓度的增加，生根效果越好，根的数量明显增加，状态良好，然而浓度较高时，虽然根的数量较多，但同时会产生少量的愈伤组织，从而影响根的生长。IBA在生根時的作用不太明显，极差（R）为17.77，浓度的增加也没有明显促进生根，但其添加对根的状态调整有一定的效果，添加时会产生大量的毛状根，根细长，色白嫩，因此添加少量的IBA可改善百合生根的质量。活性炭的添加对生根没有明显影响，极差（R）为15.57，对其生长的状态也没有太大调整作用，因此，可以考虑不添加。
　　综合以上分析，确定最佳的生根培养基为1/2 MS附加0.1 mg/L NAA和0.1 mg/L IBA，经验证生根率可达73.3%，每个不定芽生根数目较多，根较为粗壮，状态良好。挑选长势良好、生根数目较多的不定芽进行炼苗移栽，均已成活。
　　3  讨论
　　在对卡其百合进行愈伤组织诱导的过程中，发现植物生长调节剂的添加是必不可少的。其中，6-BA对百合不定芽诱导的影响最大，这与夏九成等[3]的研究结果一致，在适宜浓度范围内，随着6-BA浓度的增加，诱导出不定芽的外植体量有所增加，每块外植体上诱导出的不定芽的数目也有所增加，但当6-BA浓度过高时，反而会抑制不定芽的诱导，且褐化现象也随之增多，极易产生硬结，色暗，很难再生[4]。NAA的添加也是必不可少的，与6-BA配合后，可明显提高不定芽的诱导量[5-8]，在本试验中，NAA、6-BA和GA3合理配比后，不定芽诱导率可达83.3%，芽较粗壮，色嫩绿，褐化现象很少。GA3的添加，对百合不定芽的诱导量并无明显影响，然而，从芽的状态上看，GA3可改善不定芽的伸长生长，且色泽嫩绿，随着GA3浓度的提高，褐化现象也有所减少。
　　不同外植体部位的诱导率也有很大不同，如马怡迪等[9]、权永辉等[10]、李黛等[11]分别以百合种子、花丝、鳞片等作为外植体，研究其诱导率，发现不定芽诱导率鳞片>种子>花丝，鳞片在6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L激素培养基中，不定芽诱导率高达91%，且芽的大小、数量以及生长情况良好。吴永辉等[12]、郑思乡等[13]、徐品三等[14]研究添加物对不同百合品种与多倍体百合诱导不定芽的影响时，发现激素6-BA、NAA对不同品种以及多倍体百合均有很好的诱导作用，活性炭可以减少培养基的污染，且蔗糖浓度的增加有助于芽的增殖，其中不定芽诱导率最高为80.21%，而在本试验中，由于GA3可以促进幼苗茎的伸长生长，促进鳞茎提前萌发，经过NAA、6-BA和GA3植物生长调节剂的合理配比后，不定芽诱导率最高可达93.3%，芽较为粗壮，色嫩绿，但是有褐化现象，后续通过添加活性炭等是否可以减少褐化现象，还有待研究。
　　参考文献：
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　　[2] 吴祝华，施季森，池  坚，等.观赏百合资源与育种研究进展[J].南京林业大学学报（自然科学版），2006，30（2）：113-118.
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　　[5] 王  月.百合高效再生体系建立及遗传转化初探[D].上海：上海交通大学，2009.
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　　[7] 边红琳.杂交百合后代的组织培养[D].哈尔滨：东北林业大学，2012.
　　[8] 赵  强.青岛百合的组织培养研究[D].山东青岛：青岛农业大学，2007.
　　[9] 马怡迪，李  岳，李丹青，等.巨球百合无菌播种影响因素的研究[J].湖南农业大学学报（自然科学版），2015，41（3）：271-275.
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　　[12] 吴永辉，丰  锋.百合鳞茎不定芽诱导与增殖配方优化[J].东南园艺，2014（1）：9-12.
　　[13] 郑思乡，章海龙，董志渊，等.东方百合多倍体诱导及种球繁育的研究[J].西南大学学报（自然科学版），2004，26（3）：260-263.
　　[14] 徐品三，刘华夏.无病毒百合组培种球快速繁殖体系的建立[J].中国农业学报，2009，25（9）：174-178.
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