竹叶花椒的石蜡切片方法研究
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摘 要
目的：用石蜡切片法对竹叶花椒的显微组织结构进行研究，为竹叶花椒的生药学鉴定和质量标准研究提供依据。方法：以石蜡为包埋剂，通过浸泡、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、贴片等，制备竹叶花椒的石蜡切片，并进行显微观察。结果：竹叶花椒显微组织结构明显，具有色素块、油室、草酸钙簇晶、薄壁细胞等显微特征。结论：该方法可得到染色清晰、组织结构完整的竹叶花椒的石蜡切片，可作为竹叶花椒生药学鉴定和质量标准研究的重要方法。
关键词
竹叶花椒;石蜡切片;生药学鉴定;质量标准
中图分类号： TS264.3;O657.72 文献标识码： A
DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.16.080
竹叶花椒（Pericarpium Zanthoxyli Armati）是芸香科植物花椒属（Rutaceae zanthox ylum）竹叶花椒（Zanthoxylum armatum DC.）的干燥成熟果皮[1]，又名竹叶椒、狗椒、崖椒等。自古就是西南地区常用的中药材和香料，有麻刺感和辛辣味，具有温中理气，祛风除湿，活血止痛等功效[2，3]。现有的栽培品种如“九叶青”、“顶坛花椒”等，均为竹叶花椒。研究表明，竹叶花椒的抗炎、抗菌、镇痛、抗氧化、杀虫、抑菌等现代药理作用与其含有的挥发性、生物碱、木脂素以及黄酮类成分有关[4，5]。
竹叶花椒干燥果皮直径为4～5mm，较难进行徒手切片，而石蜡切片能够清晰完整的研究其组织结构，并能长期保存。通过对竹叶花椒横切面的显微特征研究，为其生药学鉴定和质量标准研究提供科学依据。
1 材料和仪器
1）材料：新鲜竹叶花椒，采集于贵州贞丰、贵州遵义、贵州凯里等地。
2）仪器设备：Leica DM2500光学生物显微镜;Leica RM2245半自动轮转切片机;天津泰斯特202-3AB电热恒温干燥箱。
3）试剂试药：切片石蜡（天津市科密欧化学试剂有限公司，熔点51℃～55℃），无水乙醇、95%乙醇、冰醋酸、甲醛、二甲苯、番红、固绿等均为分析纯。
2 方法
2.1 取样与固定
挑选形态完好的新鲜竹叶花椒，将其椒目与果皮剥离，将果皮一切为二，浸入70% FAA固定液（70%的乙醇90ml，冰醋酸5ml，37%甲醛5ml）中固定至少24小时。
2.2 脱水与透明
经固定后的竹叶花椒依次在不同浓度的乙醇中逐级脱水，乙醇浓度按顺序依次为70%、80%、90%、95%、100%，各级停留1小时，最后的无水乙醇应至少更换两次以便于去除水分。脱水后先用无水乙醇-二甲苯（1：1）浸泡1小时;再用二甲苯浸泡1小时，反复2次以除尽乙醇。
2.3 渗蜡与包埋
用石蜡逐步替换透明剂，渗透到果皮组织中。倒出部分浸泡竹叶花椒的二甲苯，加入少许石蜡，置于65℃恒温箱中，待石蜡熔化后浸蜡。每隔30分钟倒出原有石蜡，加入新石蜡，反复3次，置换成纯石蜡后在恒温箱中放置6小时，使石蜡充分浸入样品中。将竹叶花椒样品放入切片模具中，倒入已熔化的石蜡，迅速冷却凝固。
2.4 切片与贴片
将模具固定在切片机上，调整切片厚度进行切片，切下的薄片连成蜡带。在载玻片上滴加蒸馏水，将切好的蜡片在载玻片上展开，利用水的张力可使蜡片伸展平直，待完全展平后，可将切片位置拨正，待水分烘干后蜡片会粘贴于载玻片上，再置50℃烘箱中烘干。
2.5 脱蜡、染色与封片
将载玻片放入二甲苯中至石蜡完全溶解，而后用番红-固绿二重染色法进行染色，依次放入二甲苯→二甲苯→50%二甲苯（二甲苯：乙醇=1：1）→无水乙醇→90%乙醇→80%乙醇→70%乙醇→60%乙醇→番红染色→60%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→固绿染色→90%乙醇→无水乙醇→无水乙醇→50%二甲苯→二甲苯→二甲苯→封片，每级二甲苯和乙醇的停留时间为3分钟，番红中停留1小时，固绿中染色2分钟[6，7]。染色后的载玻片滴加中性树脂封藏剂，放上盖玻片，烘干后即得永久切片。
3 结果
显微组织结构特征[8]：竹叶花椒果皮切面为具疣状突起的圆环形。外果皮为1列扁平细胞，外披角质层，其下有1～3列下皮细胞，内含色素块;中果皮多为薄壁细胞，可见油室及草酸簇晶，并有少量的方晶及圆形淀粉粒，维管束散在，油室圆形或椭圆形（直径0.5～1mm）;内果皮为切向延长的薄壁细胞。如图1所示。
4 讨论
石蜡切片法是植物组织鉴定的常用方法，其优点可应用于大部分药材，能把样品切成均匀、连续的薄片，观察植物组织较为完整清晰，并能永久保存，缺点在于实验操作复杂烦琐，制作切片的周期较长，不能用于快速鉴别。在竹叶花椒的石蜡切片制作过程中，由于果皮硬度较大，溶液不易渗入，新鲜的竹叶花椒能制作出效果更为良好的石蜡切片。在染色剂的染色时间上，番红不易染色，至少需要停留1小时，如有需要可放置更长时间，而固绿染色较快，最好不要超过3分钟，否则，切片染色效果不佳。本文对竹叶花椒石蜡切片的研究较为深入，通过一系列操作，可得到组织完整，细胞界限清楚的植物组织，为竹叶花椒质量标准的制定提供参考依据。
参考文献
[1]湖南省食品药品监督管理局.湖南省中药材标准（2009年版）[M].湖南：湖南科技出版社，2010.
[2]陈茜.竹叶花椒质量标准研究[D].成都：成都中医药大学，2019.
[3]程友斌，王庆林，杨茹.竹叶椒的研究进展[J].安徽医药，2011，15（1）：11-13.
[4]唐小凤.竹叶椒的化学成分研究[D].兰州：兰州理工大学，2016.
[5]樊丹青，刘友平，陈鸿平.花椒本草考证[J].中药与临床，2013，4（6）：59-61.
[6]赵中振，陈虎彪，中药显微鉴定图典[M].福州：福建科学技术出版社，2016.
[7]曹蔚，薛美玲，謝艳华，等.椒目种皮的石蜡切片制备方法及显微鉴别研究[J].陕西中医，2012，33（3）：352-354.
[8]熊泉波，施大文.花椒及其同类品的形态组织学研究[J].药学学报，1991，26（12）： 938-947.
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