UPLC-MS法测定花椒及花椒制品中罗丹明B的含量

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　　摘要 [目的]建立一种花椒及花椒制品中罗丹明B的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS）的测定方法。[方法]1%甲酸溶液-甲醇（体积比为1∶1）溶液提取样品后，经固相萃取（SPE）柱净化，采用Strata-X SPE柱分离，以乙腈和乙酸铵水溶液（含体积分数为0.1%的甲酸）为流动相进行梯度洗脱，电喷雾正离子多反应监测（MRM）模式下进行定量定性分析。[结果]罗丹明B在0.5～50.0 ng/mL与峰面积呈良好的线性关系，加标回收率为96.60%～106.03%，相对标准偏差为0.83%～3.37%。[结论]该方法具有处理简单、灵敏度高等特点，可用于花椒及花椒制品中罗丹明B的定性定量分析。
　　关键词 罗丹明B;UPLC-MS;花椒;含量测定
　　中图分类号 TS207.3文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2020）02-0210-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.061
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Determination of Rhodamine B in Zanthoxylum bungeanumand Zanthoxylum bungeanumProducts by UPLC-MS
　　LIANG Wei-long1，2，WANG Bin1，LIN Qin-xian1 et al （1.Xiangxue Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guangzhou，Guangdong 510663;2.Longde Liupanshan Chinese Medicine Resources Development Co.，Ltd.，Guyuan，Ningxia 756300）
　　Abstract [Objective]To establish a method for the determination of rhodamine B in Zanthoxylum bungeanumand Zanthoxylum bungeanumproducts by ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS）.[Method]The method with 1% formic acid water solution∶methanol （volume ratio 1∶1） solution extraction samples，by solid phase extraction （SPE） column purification，using Strata-X solid phase extraction column，acetonitrile and ammonium acetate （containing 0.1% formic acid） as mobile phase with gradient elution，electrospray ionization in positive ion multiple reaction monitoring （MRM the quantitative and qualitative analysis of mode）.[Result]Rhodamine B showed a good linear relationship with peak area at 0.5-50.0 ng/mL.The recovery rates were 96.60%-106.03%，and the relative standard deviations were 0.83%-3.37%.[Conclusion]The method has many characteristics，such as simple treatment，high sensitivity，etc.The rhodamine B in Zanthoxylum bungeanumand Zanthoxylum bungeanumproducts will suitable for the qualitative and quantitative analysis.
　　Key words Rhodamine B;UPLC-MS;Zanthoxylum bungeanum;Content determination
　　花椒为芸香科植物青椒（Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc.）或花椒（Zanthoxylum bungeanumMaxim.）的干燥成熟果皮，其味辛，温，具有温中止痛、杀虫止痒的功效[1]。花椒在我国有着悠久的药用和食用历史，可作为多种食品的烹调加工调味品，为我国药食两用的原料之一[2]。但近年来关于花椒染色的报道层出不穷[3-8]，严重影响中药疗效及患者生命健康，让本就已经让人怀疑疗效的中药材以及中医行业更加“劣迹斑斑”。研究表明，罗丹明B是一种具有鲜桃红色的人工合成的染料[9]，与辣椒、花椒等调味品的天然颜色相似，且其染色能力较强、不易褪色、价格低廉，而使不法商贩们经常将其用于辣椒制品、花椒等产品的染色，以次充好。
　　目前，罗丹明B的檢测方法有UV-Vis、HPLC、LC-MS等[10-13]，但存在定性能力不足、方法专属性差、抗干扰能力差、耗时较长、假阳性较高等问题，现有方法不能满足大批量样品的分析测试需要，因此笔者基于固体萃取前处理技术，采用UPLC-MS建立一种花椒及花椒制品中罗丹明B的检测方法。
　　1 材料与方法 　　1.1 仪器 TQ型超高效液相色谱-串联质谱仪（Waters）、20-Port型固相萃取装置（Waters）、3-18K型高速冷冻离心
　　机（SIGMA）、UGC-24W型氮吹仪（北京优晟联合科技有限公司）、JP-C600型超声波清洗机（广州市吉普超声波电子设备有限公司）、DT-500E型电子天平（常熟市金羊砝码仪器有限公司）、PL203型分析天平（梅特勒-托利多）、MS3 basic型涡旋混合器（德国艾卡）、HWS26型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）。
　　1.2 试材 罗丹明B（纯度95.0%，Dr Ehrenstorfer）;正己烷（HPLC，TEDIA）;甲醇（HPLC，TEDIA）;乙腈（HPLC，TEDIA）;其他试剂均为分析纯;超纯水;Oasis MCX固相萃取柱、Strata-X SPE固相萃取柱、C18 SPE固相萃取柱，使用前全部依次用3 mL甲醇、3 mL超纯水进行预处理;市售花椒及花椒制品共20份，经广州市香雪制药股份有限公司康志英高级工程师鉴定为芸香科植物青椒（Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.）或花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）的干燥成熟果皮/果皮加工品。
　　1.3 方法
　　1.3.1 色谱条件。Waters BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流动相乙腈（A）和5 mol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）（B）;按表1中的规定进行梯度洗脱，流速0.3 mL/min;柱温为35 ℃;进样量为5 μL;离子源：电喷雾离子源（ESI）;扫描方式：正离子扫描;采集方式：多反应监测（MRM）;脱溶剂气流速：800 L/h;脱溶剂气温度：500 ℃;电离源电压：2.82 kV;气帘气流速：50 L/h。罗丹明B母离子m/z：443.1;子离子对m/z：443.1/355.0;定量离子m/z：355.0;锥孔电压：70.0 eV;碰撞能量：60.0 eV。
　　1.3.2 标准储备液的制备。取罗丹明B标准品适量，精密测定，加甲醇制成100 μg/mL的标准储备液，备用。
　　1.3.3 标准工作液的制备。精密量取“1.3.2”标准储备液，用甲醇制成分别含0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/L的溶液，即得。
　　1.3.4 供试品溶液的制备。取本品粉末（过3号筛）约2 g，精密测定，置50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL 1%甲酸溶液-甲醇（体积比为1∶1）提取溶液，在涡旋混合器上涡旋混匀，超声提取30 min，4 ℃下离心5 min（8 000 r/min），取上清液转移至另一50 mL聚丙烯离心管中，重复操作，合并上清液，混匀备用。将收集到的上清液过经过预处理后的Strata-X SPE柱，柱中液体保持2 mm左右时进样，流速为1滴/s，待样液完全流出后，用3 mL淋洗液、3 mL水进行淋洗，再用5 mL洗脱液洗脱，收集洗脱液，氮气吹至近干，用甲醇定容至1 mL，涡旋混匀，即得。
　　1.3.5 线性关系考察。分别精密吸取“1.3.3”不同浓度的标准工作液5 μL，按“1.3.1”的色谱条件进样分析，记录罗丹明B的峰面积，以进样量（X）为横坐标峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。
　　1.3.6 精密度考察。取浓度为10.0 ng/mL的标准工作液，精密吸取5 μL，按“1.3.1”的色谱条件进样分析，重复进样6次，分别记录罗丹明B的峰面积。
　　1.3.7 加标回收率试验。准确称取相同的空白阴性花椒试样5份，分别加入1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL 5个不同水平浓度的罗丹明B标准溶液，平行测定5次，计算回收率。
　　1.3.8 样品测定。分别称取花椒及花椒制品的样品，按“1.3.4”方法制备供试品溶液，每个样品平行3次，进样测定，以均值为结果，计算样品中罗丹明B的含量。
　　2 结果与分析
　　2.1 对照品与样品的UPLC-MS色谱图 从图1可以看出，相同的分析条件下，样品溶液在对照品溶液相同出峰时间（t=3.0 min）中有一个峰出现，分离度良好，且空白无干扰，说明此条件适合罗丹明B的含量测定。
　　2.2 线性关系考察 以进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得出罗丹明B的回归方程为Y=3 458X-42.939（R2=0.999 7），表明在0.5～50.0 ng/mL浓度范围内具有较好的线性关系。
　　2.3 精密度考察 按“1.3.6”的方法重复进样6次，记录罗丹明B的峰面积，结果发现罗丹明B峰面积的RSD为1.93%，表明仪器的精密度良好。
　　2.4 加标回收率试验 按“1.3.7”方法进行操作，分别加入不同水平浓度的罗丹明B标准溶液，平行测定5次，结果发现（表2），罗丹明B的回收率为96.60%～106.03%，RSD为0.83%～3.37%。表明该方法回收率良好。
　　2.5 罗丹明B含量测定
　　将不同批次的供试品溶液在“1.3.1”的色谱条件下进行分析，通过对比样品与标准品的保留時间和特征碎片离子，对样品进行定性。利用标准品的色谱峰面积和浓度关系，建立校正曲线，对样品进行定量分析。由分析结果可得，从市场购买的20批不同产地、不同规格的花椒及花椒制品中，仅检出1个阳性样品，含量为10 μg/kg，整体产品质量状况良好。由于检测含量较低，人为添加的可能性较低，可能是由于花椒在生产过程中被污染而带入。 　　3 结论与讨论
　　该试验考察了超声提取、回流提取、液-液萃取的方法，超声提取操作简便，所需时间较短，提取后直接用离心的方式对提取液进行初步净化处理，与普通的过滤方法相比，不仅加快了过滤速度，而且减少了待测组分的损失，提高了回收率，因此该试验选择超声提取。提取溶剂考察了正己烷、乙腈和1%甲酸溶液-甲醇（体积比为1∶1）3种提取试剂，正己烷的毒性相对较小，但其提取程度较低;乙腈和1%甲酸溶液-甲醇（体积比为1∶1）2种溶液的提取程度相差不大，但乙腈的毒性强于甲醇，且有较强的特殊性气味，因此，选用1%甲酸溶液-甲醇（体积比为1∶1）溶液作为提取试剂较为合理、安全。另外，净化柱的选择上，不同的净化柱价格相差不大，但Strata-X SPE柱对1%甲酸溶液-甲醇（体积比为1∶1）提取液中的目标化合物的保留程度较Oasis MCX SPE柱和C18 SPE柱好，因此选择Strata-X SPE柱作为净化柱。
　　此次研究通过采用UPLC-MS法测定花椒及花椒制品中罗丹明B的含量，结果表明，该方法前处理简单快速、高灵敏度、准确性好、分析时间短及可操作性强，可用于大批次花椒及花椒制品中罗丹明B的定性定量分析。
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