金黄色葡萄球菌快速检测方法研究进展

来源:用户上传      作者:刘启超 唐一通 刘雪妮 王梦晓 傅琴琴 肖娜

　　[摘 要]金黄色葡萄球菌是引起医院感染和食物中毒的重要病原菌，建立和发展快速检测方法对于该菌的诊断和防控具有重要意义。该文对基于免疫磁珠分离技术开展金黄色葡萄球菌快速检测的方法进行了探究，是今后开展病原菌检测的发展方向。
　　[关键词]金黄色葡萄球菌;免疫磁珠;快速检测
　　[中图分类号] R155.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-9324（2020）47-0-03 [收稿日期] 2020-05-31
　　金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）广泛分布于人的体表、上呼吸道等部位，是最常见的人体致病菌之一，其既可引起院内感染和社区获得性感染，也是重要的食源性感染的病原菌[1]。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的出现和迅速传播，使得金黄色葡萄球菌的感染变得越来越难以治疗，已成为抗感染治疗的一大难题[2]。
　　目前，有多种基于细菌培养、分子生物学、免疫学以及生物传感器等原理的金黄色葡萄球菌检测方法。随着免疫磁性微球技术在生物医学领域的广泛应用，基于免疫磁珠技术的病原菌快速检测技术得到快速发展。免疫磁性分离技术是通过将抗原抗体等识别物包被在具有一定粒径范围的超顺磁性纳米磁珠上，利用磁珠的磁响应性对目标物进行富集分离的技术。因该技术操作简单快速，特异性和灵敏度高，近些年在蛋白、核酸纯化，细胞分离以及病原菌检验等领域有着广泛应用。本文总结了基于免疫磁分离技术开展金黄色葡萄球菌快速检测的方法。
　　一、免疫磁珠直接富集分离法
　　周莉等[3]利用羧基聚苯乙烯磁性微球、兔抗金黄色葡萄球菌多克隆抗体对食品样品中的金黄色葡萄球菌进行富集分离，具有较好的特异性和灵敏度。敏感性测定结果显示，经免疫磁性微球富集和平板培养，可从细菌浓度为14cfu/mL的培养液中检出金黄色葡萄球菌，灵敏度远高于直接涂板计数方法。该方法可用于牛奶、酱油和速冻水饺等样品中金葡菌的微量检测。吴俊等[4]利用直径20nm的裸磁珠对培养液中的金黄色葡萄球菌具有较好的吸附能力，对浓度为102～107cfu/mL的培养液中的细菌吸附率可达95%以上，最大吸附量为6×108cfu/mg。磁珠吸附富集的菌体提取DNA，可满足荧光PCR测定需要。
　　黄焕宜[5]等将鼠抗金黄色葡萄球菌抗体偶联至Fe3O4纳米磁性微球上制备免疫磁性微球，对金黄色葡萄球菌具有较高的捕获能力，当菌液浓度为103cfu/mL时，捕获能力可达73%，捕获能力随着菌液浓度的增高而下降。王程程等[6]利用链霉亲和素磁珠和生物素化兔抗金葡菌多克隆抗体制备免疫磁珠，用其分离食品中的金黄色葡萄球菌，捕获灵敏度可达10cfu/mL，用时小于1h，可用于对食源性金黄色葡萄球菌的快速检测。
　　二、免疫磁珠—多重聚合酶链式反应（Multiple Polymerase Chain Reaction，MPCR）
　　周丽珍等[7]利用亲和素标记的磁珠和生物素标记的spa单克隆抗体制备免疫磁珠从痰液中富集金黄色葡萄球菌，再联合多重聚合酶链式反应（multiple polymerase chain reaction，MPCR）檢测痰液样本中MRSA菌株mecA基因和femA基因，进行MRSA菌株的检测。与常规细菌培养+Vitek-2全自动微生物分析仪相比，在检出率、敏感性和特异性等方面均有优势，尤其是可将检测时间有原来的48～72h，缩短至4～6h。该方法可以对临床患者痰液样本中的MRSA进行敏感、特异、快速的检测，有助于MRSA菌株的诊断与控制。
　　三、免疫磁珠富集—PCR法
　　邓奕等[8]将金黄色葡萄球菌多抗偶联于500nm超顺磁性微球制备免疫磁性微球，联合PCR方法检测牛奶中金黄色葡萄球菌进行检测。建立方法具有较高检测特异性和灵敏度，不需增菌培养，检测灵敏度为104cfu/mL。高涛[9]等利用免疫磁珠—实时荧光PCR技术对586份各类食品样品中的单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌3种致病菌进行检测，并与传统培养方法比较，两种方法符合率为93.22%，而且新方法可在2h～3h内得出检测结果，大大缩短了检测时间，是一种可推广应用于食源性微生物检测的方法，也可以应用于突发公共卫生事件应急检测。
　　马凯等[10]利用超顺磁性纳米微球和金黄色葡萄球菌、志贺氏菌多克隆抗体制备免疫磁珠，从猪鲜肉中捕获两种病原菌，提取核酸后，使用两重荧光定量PCR法进行快速核酸检测，对两种细菌的检测限可达2.52cfu/g和1.36cfu/g，是一种可以快速进行食源性金黄色葡萄球菌和志贺菌检测的方法。
　　四、免疫磁珠—ATP发光检测技术
　　ATP发光检测技术具有简便快速和重现性好的特点，但是该技术灵敏度较低，最低检测限为103个细菌/mL，不符合卫生学检验要求。但将该技术与免疫磁珠分离技术相结合，则在微生物检测、细胞分离等领域有着越来越广泛的应用。寇晓晶等[11]将免疫磁珠和ATP生物发光技术联合，建立了一种快速检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌等食品中常见致病菌的新方法，能够大大降低检测限，检测灵敏度可达102cfu/mL。
　　五、免疫磁珠—重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）
　　重组酶聚合酶扩增是恒温扩增技术的一种，相较传统的PCR扩增技术，具有较高的灵敏性，而且能够在简便而无须昂贵实验设备条件下开展应用，能够在基层开展应用。近年来在食源性病原微生物检测及医学诊断领域得到快速发展。王亚磊[12]将制备的金黄色葡萄球菌单克隆抗体与直径为750nm的羧基磁珠偶联制备免疫磁珠，用于捕获样品中的金黄色葡萄球菌，有较好的捕获率和特异性，捕获灵敏度可达102cfu。同时，针对金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因设计RPA引物并进行反应条件的优化后，利用免疫磁珠-RPA-LF技术对金葡菌基因组的最低检测灵敏度可达600fg。通过对牛奶样品中金葡菌的检测显示，当样品中金葡菌浓度低至7.5×102cfu/mL时，亦可检出阳性结果。 　　六、免疫磁珠—环介导等温扩增技术
　　环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是NotomiT等[13]在2000年开发的一种新型的恒温核酸扩增方法，其特点是选取检测目的基因6个区域设计4—6条特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件下进行核酸扩增。与传统PCR技术比较，无须温度循环过程，避免了对温度循环和PCR仪器设备的需求，具有简单、快速、特异性强的优点。在病原菌检测、临床诊断、环境和食源安全检测领域有广泛应用前景。
　　吕观等[14]将免疫磁珠和环介导等温扩增技术相结合，将生物素标记的鼠伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌抗体偶联于链酶亲和素磁珠上制备免疫磁珠，每毫克磁珠与6?L金黄色葡萄球菌抗体结合，对104cfu/mL金黄色葡萄球的捕获效率可达56.80%。用建立的免疫磁珠-LAMP方法，针对nuc基因设计检测引物，对牛肉中金黄色葡萄球菌的检测灵敏度可达4.4cfu/mL，可以有效地從牛肉中检测金黄色葡萄球菌。
　　许会会[15]将制备的金葡菌多抗包被至二氧化硅磁珠表面制备免疫磁性微球，对牛奶中金葡菌的检测灵敏度可达2.81×102cfu/mL。结合LAMP方法，检测金葡菌nuc基因，对采集的牛奶样品检测限可达5cfu/mL。
　　七、免疫磁珠—量子点技术
　　白冰等[16]将生物素化兔抗金葡菌多抗偶联于链亲和素磁珠制备免疫磁性微粒，用其富集金黄色葡萄球菌，再利用量子点荧光标记和微型光纤光谱仪进行菌体检测。结果表明，对金葡菌最佳富集条件为捕获时间45min，磁分离1.5min，PBS浓度10mmol/L，可以捕获103cfu/mL浓度的菌液。整个检测可以在2h内完成，并且具有较高的特异性。
　　李倩倩等[17]建立了一种免疫磁珠和量子点相结合检测金葡菌、志贺菌和沙门菌的方法。先用包被有三种目标菌多抗的免疫微球富集目标菌，再加入用多色CdSe量子点交联的抗金葡菌、抗志贺菌和沙门菌多抗反应，通过荧光显微成像法进行检测。结果显示，可在2h内对同一反应体系中的3中目标菌进行快速检测，对样品中目标菌的检测表明检测灵敏度可达103cfu/mL，表明该方法是一种能够快速、特异灵敏地检测金黄色葡萄球菌的方法。
　　八、结论
　　金黄色葡萄球菌引起的感染和食物中毒是一个世界性的公共卫生问题，基于细菌培养的传统方法虽然是目前通用的检测方法，但是需要较长的培养时间，不能进行快速和微量检测，不利于尽早诊断和治疗。而随着相关生物检测技术的发展，基于分子生物学、免疫学以及生物传感器等快速且高灵敏度检测方法，将是今后开展病原菌检测的发展方向。
　　参考文献
　　[1]郭燕，朱德妹，胡付品，等.2010年中国CHINET葡萄球菌属细菌耐药性监测和分析[J].中国感染与化疗杂志，2013，13（02）：86-92.
　　[2]Vossenkuhl B，Brandt J， Fetsch A，et al.Comparison of spa types，SCCmec types and antimicrobial resistance profiles of MRSA isolated from turkeys at farm，slaughter and from retail meat indicates transmission along the production chain[J].Plos One，2014，9（5）： e96308.
　　[3]周莉，王永，王法云，等.免疫磁珠检测食品中金黄色葡萄球菌的研究[J].河南科学，2015，33（07）：1119-1123.
　　[4]吴俊，陆利霞，刘元建，等.基于裸磁珠的金黄色葡萄球菌富集优化[J].现代食品科技，2019，35（02）：186-192.
　　[5]黄焕宜，肖树荣，谢淑贤，等.应用免疫磁性微球快速鉴定金黄色葡萄球菌[J].中国国境卫生检疫杂志，2019，42（02）：81-83.
　　[6]王程程，李敏通，王蓉晖，等.基于免疫磁珠快速分离金黄色葡萄球菌的研究[J].食品工业科技，2013，34（09）：175-178+182.
　　[7]周丽珍，耿先龙，赵琪.痰液耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速检测及其临床应用[J].南通大学学报（医学版），2017，37（04）：322-324.
　　[8]邓奕，许迪莘，赵琳娜，等.免疫磁球捕获-PCR检测牛奶中金黄色葡萄球菌的研究[J].食品工业科技，2015，36（07）：304-307+313.
　　[9]高涛，张丽萍，魏雯，等.免疫磁珠富集-实时荧光PCR技术在食源性致病菌监测中的应用研究[J].医学动物防制，2017，33 （01）：18-20.
　　[10]马凯，武会娟，范筱京，等.免疫磁分离-两重荧光定量PCR法快速检测鲜猪肉中金葡菌和志贺氏菌[J].分析仪器，2016（S1）： 24-27.
　　[11]寇晓晶，高峰，谢春，等.3种食源性细菌免疫磁珠联合ATP发光检测技术研究[J].中国动物检疫，2019，36（01）：85-91.
　　[12]王亚磊.基于免疫磁分离的金黄色葡萄球菌RPA-LF快速检测方法的建立[D].中国农业科学院，2019.
　　[13]Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Research，2000，28 （12）：E63.
　　[14]吕观，常彦磊，石磊.免疫磁珠-环介导等温扩增快速检测牛肉中的鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌[J].肉类研究，2019， 33（07）：42-48.
　　[15]许会会.基于免疫磁珠与环介导等温扩增的牛奶中金黄色葡萄球菌检测方法的建立[D].吉林大学，2011.
　　[16]白冰，等.基于免疫纳米磁珠和量子点快速检测两种食源性致病菌方法的研究[D].西北农林科技大学，2014.
　　[17]李倩倩，陈萍，王静，等.基于多色量子点和免疫磁珠技术检测沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌[J].卫生研究，2013，42 （04）：660-663.
转载注明来源:https://www.xzbu.com/9/view-15378004.htm