薏苡黑穗病快速检测方法研究

来源:用户上传      作者:

　　摘要 以薏苡黑穗病菌粉胞内蛋白为免疫原，制备抗体，建立薏苡黑穗病ELISA检测方法。结果表明，测定纯化后抗体的最高效价为1∶800 000，具特异性强;方阵试验测定抗原的最佳包被浓度为10.3 CFU/mL，抗体的工作浓度为1∶4 000;优化ELISA检测条件，确定抗体4 ℃过夜（8～12 h）包被效果最好，选择1%酪蛋白作为抗体的封闭液，抗体的最佳封闭时间为 1.5 h，抗体的最佳孵育时间为2.5 h，最佳底物作用时间为15 min;建立ELISA标准工作曲线，表明抗体的灵敏度为10.4 CFU/mL。ELISA检测田间采集的黑穗病病叶显示，抗体可与病叶提取液发生特异性反应，而与健康叶提取液呈阴性反应，由此可确定黑穗病的存在与否。该方法可用于田间薏苡黑穗病快速检测，以及时指导病害防治。
　　关键词 薏苡黑穗病;抗体;酶联免疫反应
　　中图分类号 S435.19  文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2020）05-0197-04
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.056
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract The antibody was prepared by the immunogen with the intracellular protein in Coix lacrymajobi smut fungus powder， and the ELISA detection method was established. The results showed that the titer was 1∶800 000 of the purified antibody，which had high specific.The square matrix test to determine the optimal coating concentration of the antigen was 10.3 CFU/mL， and the working concentration of the antibody was 1∶4 000;the optimization ELISA detection conditions were antigen blocked for night （8-12 h） at 4  ℃， 1% cottomin of the assay buffer blocked for 1.5 h， antigen incubated for 2.5 h， the reaction time of coloration was 15 min. The standard curves of ELISA was established，which showed that the antibody sensitivity was 10.4 CFU/mL.ELISA detection of smut diseased leaves collected in the field showed that the antibody could be specific reaction with the extracted solution of disease leaves，and it be negative reaction with extracted solution of healthy leaves， which could confirm the presence or absence of smut.The method can be applied to detect cucumber bacterial white spot disease in field and direct the disease control in time.
　　Key words Coix lacrymajobi smut;Antibody;ELISA
　　薏苡（Coix lacrymajobi L.）是我國重要的药粮兼用的经济作物，具有极高的营养价值。薏苡在我国分布广泛，主产贵州、广西、云南、福建等省[1]。目前，贵州省薏仁米种植面积、产量均居全国第一，生产量占全国2/3[2]。贵州省各地薏苡种植分散，生产以农民自留当地农家种为主，种植区域没有实行合理布局，难以实现产业化、规模化，导致薏苡病害多发，尤其是由薏苡黑穗病最为严重，可使产量下降30%～50%，严重时减产80%[3-5]。
　　近年由于薏苡品种杂乱，导致黑穗病对薏苡的生长危害日趋严重，严重影响薏苡的产量和品质，对农户的经济收入造成严重的影响以及制约薏仁米产业的发展。对薏苡感黑穗病后建立快速检测的方法报道较少，而采用建立酶联免疫吸附剂测定（ELISA）技术检测早期薏苡感染黑穗病的方法鲜见报道，至1976年首次采用应用于植物病毒检测[6]后，该方法被用于植物、动物、医学上对病原菌及农药残留等快速检测的有效手段[7-9]，该技术方法为一类通过固相载体进行酶联免疫染色的免疫酶标，其特点具有特异性较强、高灵敏度、易操作、快速准确，对于生产上常规方法难以检测的病害具有独特优势。目前国内采用ELISA 技术成功检测各种病害，孙艳秋等[10]建立ELISA方法对黄瓜细菌性白枯病菌检测结果表明抗体的灵敏度为10.5 CFU/mL;Tsuchiya等[11]制备了番茄和辣椒细菌性斑点病菌的单克隆抗体;宁红等[12]用I-ELISA方法检测水稻细菌性条斑病菌，通过ELISA测定灵敏度可达10.3～10.4 CFU/mL。该研究以薏苡黑穗病菌菌丝蛋白作为免疫原，制备了多克隆抗体，并建立了快速灵敏的薏苡黑穗病ELISA检测体系，为进一步进行针对薏苡黑穗病的快速检测试剂盒的研究奠定了基础。 　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　菌种：薏苡黑穗病（Ustilago coicis Brefeld）由贵州省农业科学院亚热带作物研究所分离保存;试验动物：采用雌性2月龄新西兰大白兔2只进行试验，购自四川农业大学实验动物中心。该试验于2017 年 5月在成都百奥森斯生物科技有限公司进行。
　　1.2 兔多抗免疫
　　菌粉及菌体胞内蛋白提取参考刘云霞等[13]与许莉萍等[14]方法;共进行3次免疫，采取3点注射（颈部注射0.8 mL，左右两侧大腿腋窝分别注射0.4 mL）。每次每只新西兰大白兔抗原免疫用量为0.8 mg（0.8 mg/mL的蛋白浓度），初次免疫用等体积弗氏完全佐剂乳化，第2、第3次免疫用等体积弗氏不完全佐剂乳化，首次免疫前耳缘静脉采血作为阴性对照，末次免疫后第7天采血进行ELISA检测，血清效价达1∶100 000以上，采集终血，然后分离血清。应用间接ELISA方法测定抗体效价。
　　1.3 抗体纯化及抗体HRP标记
　　血清用PBS（20 mmol/L，pH 7.4）进行稀释，稀释比例1∶5的体积比进行，稀释后上样Protein A亲和层析柱，血清的体积不要高于层析柱体积的2倍，然后使用PBS洗涤3个柱床体积，再加入0.1 mol/L 甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 2.0）进行洗脱，得到的抗体马上使用1 mol/L Tris-HCl（pH 9.0）进行中和，之后透析换液为PBS，加入50%的甘油与0.3%Proclin 300并分装置于-80  ℃保存;抗体HRP标记采用过碘酸钠法。
　　1.4 间接ELISA方法 首先将抗原和抗体按不同浓度稀释，使用方阵滴定法将浓度为10.9 CFU/mL的薏苡黑穗病菌粉按10、10.2、10.3、10.4 CFU/mL稀释成4个浓度梯度，将纯化抗体按1∶1 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000稀释成4个系列，然后确定抗原包被浓度以及抗体的最适工作浓度;供试包被菌液浓度设定为10.4 CFU/mL，选用4  ℃ 2 h与4  ℃过夜（8～12 h）及在培养箱中37  ℃分别孵育0.5、1.0、2.0 h共5个时间点进行最佳的包被温度与包被时间的选择;采用1.0%脱脂奶粉、1.0%酪蛋白、1%牛血清蛋白3种蛋白进行封闭处理，选择最佳封闭蛋白;封闭时间分别设定为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h置于37  ℃恒温培养箱封闭处理，选择最佳的封闭时间;抗体孵育时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h置于37  ℃恒温培养箱孵育，选择最佳孵育时间;最后将显色时间分别设定为5、10、15、20、25 min，进行显色反应，试验均设3次重复。
　　1.5 建立间接 ELISA 方法的标准曲线 将薏苡黑穗病菌配成10、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6 CFU/mL 6个浓度，以薏苡黑穗病菌粉液浓度对数为横坐标、抑制率为纵坐标绘制标准曲线，评价该检测方法的灵敏度。抑制率I=（B0-B）/B0（B为样品OD值，B0为空白对照OD 值）。
　　1.6 采用ELISA方法检测薏苡黑穗病病叶样品
　　取薏苡黑穗病的病叶样品，加入包被液匀浆研磨混匀，室内静置10 min，即获得测定样品溶液，薏苡健康叶片为试验对照进行ELISA检测。
　　2 结果与分析
　　2.1 ELISA技术多克隆抗体制备及HRP标记后的抗体效价
　　首次免疫前耳缘静脉采血作为阴性对照，末次免疫后第7天采血进行ELISA检测，血清效价达到1∶100 000以上，采集终血，然后分离血清。应用间接ELISA方法测定抗体效价。由表1可知，采用薏苡黑穗病病原菌（贵1）得到效价为1∶243 000;而采用薏苡黑穗病菌粉（贵2）得到效价为1∶400 000，可见兔血清效价合格，可采全血;采用辣根过氧化物酶（HRP）催化过氧化氢（H2O2）和氢供体（DH2）生产有色的氧化性染料放大信号用于检测。经HRP的抗体贵1为1∶450 000，贵2抗体为1∶800 000，并且进行了间接ELISA检测，效价得到了有效的提升;以下试验均采用贵2（黑穗病菌粉）抗体进行。
　　2.2 间接ELISA方法最佳工作条件的确定
　　2.2.1 抗原包被浓度与抗体稀释的方阵滴定。从方阵滴定试验结果（图1）可以看见，抗体稀释浓度1∶1 000吸光度均高于其他稀释浓度，即随着抗体浓度的降低吸光度也呈降低的趋势，在抗体稀释浓度1∶4 000时也呈现相对较高的吸光度，因此选择 OD490在1.0 左右的抗体稀释浓度为最佳稀释浓度。由此可见，抗体的工作浓度为 1∶4 000，而抗原的最佳包被浓度为10.3 CFU/mL。
　　2.2.2 包被温度和时间及最佳封闭液的确定。
　　测定包被2种温度（4和 37 ℃）下及不同包被时间对测试样品OD值的影响，结果表明（图2），在设置的5个时间段内，除4 ℃处理2 h外，在490 nm下的OD值差异不大，说明在 4、37 ℃ 2种温度条件均可成功包被，而抗体在4 ℃过夜处理8～12 h包被效果较其他处理好，另外37 ℃处理2 h能有效缩短试验时间。由图3可见，在供试的3种封闭液中，1%酪蛋白封闭效果最佳;1%脱脂奶粉封闭较其他处理其OD值最低，即效果差;而1%牛血清蛋白封闭的OD值介于两者之间，与1%酪蛋白差异较少，可替代 1%酪蛋白作封闭液使用，但基于最佳封闭液选择，故该试验中选择浓度1%酪蛋白作为抗体的封闭液。
　　2.2.3 最佳封闭时间、最佳抗原抗体反应时间及最佳底物作用时间的确定。
　　最佳封闭时间设定为 1～3 h，由图4a可见，封闭时间增加，吸光度呈先上升后降低的趋势，而封闭时间1.5 h后吸光度略高于其他处理而趋于平稳，推测此时抗体与酶反应板之间的结合力达到最大;故将抗体的封闭时间确定为1.5 h。试验设定抗体孵育时间共5组（图4b），随着时间的延长，其吸光度呈现先增加后降低的趋势，且最大吸光度在2.5 h 时出现，而3 h后开始降低，故将抗体的最佳孵育時间确定为2.5 h;对底物显色时间的测定结果（图5）显示，时间在 0～15 min柱形图呈上升趋势，吸光度也逐渐增大，15 min后吸光度开始降低，且与处理20 min后的吸光度差异不明显。 综上所述，为提高检测效率、缩短反应时间，特将底物反应显色时间确定为15 min。 　　2.3 建立间接 ELISA 方法的标准曲线
　　将薏苡黑穗病菌粉配成不同浓度按“2.2.2”和“2.2.3”优化条件进行间接 ELISA 方法测定，以黑穗病菌粉液浓度对数为横坐标、抑制率为纵坐标绘制标准曲线，评价其灵敏度;检测结果显示（图6），薏苡黑穗病菌粉在60%～75%线性关系良好，即抗体的检测线性范围为 10.3～10.5 CFU/mL，所以该方法对薏苡黑穗病的检测灵敏度为 10.4 CFU/mL。
　　2.4 采用ELISA方法检测薏苡黑穗病病叶样品
　　采用ELISA 方法对薏苡黑穗病病叶的提取液进行检测，将提取液包被酶标板4 ℃过夜处理8～12 h后，以1%酪蛋白封闭液进行封闭处理，置于 37 ℃恒温箱中温育封闭l.5 h，加入薏苡黑穗病菌抗体和病叶提取液，再放入 37 ℃恒温箱中孵育 2.5 h，加入稀释4 000倍的HRP-羊抗兔IgG后再次放入 37 ℃恒温箱中孵育2.5 h，最终加入底物基质液反应15 min后终止反应并测定 OD490。结果表明（表2），病叶提取液的 P/N为 4.8，对照健康叶片提取液为阴性反应，表明建立的改良 ELISA 方法可准确检测出病叶中的薏苡黑穗病病菌。
　　3 小结与讨论
　　关于植物病原真菌的血清学检测中，一般可以将抗体分为2种，分别为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb） 是由一个B淋巴细胞产生，针对一种抗原决定簇的抗体[15]， 因具有特异性强、稳定性高、可无限量生产等优点，但真菌结构与物质组成极为复杂，寻找具有特异性抗原极其困难[16-17]。而多克隆抗体（polyclonal antibody，PAb）是由多种抗原决定簇刺激机体后相应地产生多种多样的单克隆抗体，把这些单克隆抗体组合在一起就称为多克隆抗体，虽其在某些情况下特异性不如单克隆抗体，但具有制备时间短、制备方法简单便捷、成本较单克隆抗体费用低的特点，所以仍被广泛研究和应用于生物、医学等领域对病原微生物的检测[18]。
　　 近年来，在薏苡种植生产中存在的问题有品种单一、优良品种少、品种退化等问题日益突出，导致薏苡抗性差、病害多发，其中以薏苡黑穗病最为严重，严重制约了薏苡产业的发展，该病系由担子菌亚门黑粉菌属冬孢子引起的全株系统性真菌病害[3，19]，病斑最早出现在分蘖期的叶片上，一般在植株抽穗期病情大规模暴发，防治极其困难，对已发病的植株生产上暂无特效药剂进行防治，因此建立一套早期检测薏苡黑穗病的方法势在必行。目前，一般采用分子生物技术对一些常规病害进行检测，但因其成本高与使用精密的仪器，对操作者的要求较高，而且一般局限于实验室使用，而ELISA方法的操作相对简单快捷，具有特异性好、灵敏度高、成本低等优点，而且可以开发成试剂盒的形式，更适用于大规模田间样品的检测与基层推广。该研究以薏苡黑穗病菌菌丝与菌粉的胞内蛋白为抗原，获得了黑穗病菌的多克隆抗体，效价分别为1∶450 000与1∶800 000，具有非常理想的效价与特异性。目前已报道ELISA的灵敏度一般为10.5～10.6 CFU/mL，对于鉴定常规病害的病原菌是足够的[20]，该试验最佳的抗原抗体工作浓度已确定，并对各项反应条件进行初探优化，同时对建立的 ELISA 方法进行了薏苡黑穗病病叶的检测，采用10.4 CFU/mL对供试植物病原菌检测P/N为 4.8>2.1，而健康叶片呈阴性反应P/N<2.1，可见其特异性较好，结果准确可靠，为薏苡黑穗病快速诊断提供了有效的技术手段，具有良好的应用前景。
　　参考文献
　　[1]高微微，赵杨景，何春年.我国薏苡属植物种质资源研究概况[J].中草药，2006，37（2）：293-295.
　　[2]蒙秋伊，刘鹏飞，张志勇.薏苡种质资源及育种研究进展[J].贵州农业科学，2013，41（5）：33-37.
　　[3]李戈，彭建明，高微微，等.我国南方薏苡种质资源对黑粉病的抗病性鉴定[J].中国中药杂志，2010，35（22）：2950-2953.
　　[4]杨文成，杨红. 薏苡黑穗病的研究初报[J].植物医生，1997（6）：35-36.
　　[5]朱立强，刘根节.薏苡黑穗病的防治[J]. 特种经济动植物，2005（10）：39.
　　[6]VOLLER A，BARTLETT A，BIDWELL D E，et al.The detection of viruses by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）[J].Journal of general virology， 1976，33（1）：165-167.
　　[7]熊国如，张雨良，赵婷婷，等.海南蔗区甘蔗黄叶病与花叶病发生情况的分子鉴定[J].热带作物学报，2011，32（12）： 2307-2311.
　　[8]熊雅婷，邢维维，白莲英，等.蔬菜中拟除虫菊酯残留 ELISA快速检测试剂盒的研制[J].食品安全导刊，2017（31）：34-39.
　　[9]黄炳炽，林仰孝，刘芳，等.应用 ELISA方法检测多种动物弓形虫抗体[J].畜牧兽医科技信息，2019（7）：35-36.
　　[10]孙艳秋，赵奎华 ，刘长远，等.黄瓜细菌性白枯病菌ELISA检测方法的建立[J].沈阳农业大学学报，2012，43（5）：528-533.
　　[11]TSUCHIYA K，D′URSEL C C M.Development of a sensitive ELISA using three monoclonal antibodies against lipopolysaccharides to detect Xanthomonas campestris pv.vesicatoria，the causal agent of bacterial spot of tomato and pepper[J].Journal of general plant pathology，2004，70：21-26.
　　[12]宁红，陶家凤，江式富.用酶联免疫吸附技术（ELISA）检测水稻细菌性条斑病菌的研究[J].植物检疫，1991，5（2）：94-97.
　　[13]劉云霞，张青文，周明祥.电镜免疫胶体金定位水稻内生细菌的研究[J].农业生物技术报，1996，4（4）：354-358.
　　[14]许莉萍，赖文姜，罗瑞仙，等.分泌抗水稻细菌性条斑菌单克隆抗体杂交瘤株的建立及其在种子检验上的应用[J].华南农业大学学报，1990，11（2）：9-15.
　　[15]孔君，刘箐，韩跃武，等.单克隆抗体制备技术的最新进展及应用前景[J].免疫学杂志，2011，27（2）：170-173.
　　[16]WU J X，NI Y Q，LIU H，et al.Development and use of three monoclonal antibodies for the detection of rice blackstreaked dwarf virus in field plants and planthopper vectors[J].Virology journal，2013，10（1）：1-10.
　　[17]窦坦德，沈崇尧.植物病原真菌检测技术研究进展[J].植物检疫，2000，14（1）：31-33.
　　[18]刘卉秋，吴素文，曹远银，等.玉米弯孢菌叶斑病菌ELISA检测方法的建立[J].江苏农业科学，2008，36（3）：59-61，90.
　　[19]刘荣，申刚.薏苡黑穗病拮抗菌的分离鉴定及其发酵条件优化[J].江苏农业科学，2017，45（13）：97-100.
　　[20]刘学敏，孟玉芹.植物病原细菌检测和细菌病害诊断方法[J].菌物研究，2009，7（3/4）：211-217.
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15152532.htm