基于纳米孔单分子技术的抗结核药物异烟肼的检测新方法
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摘要：纳米孔单分子分析技术是通过不同的压力驱动分子通过纳米孔，监测分子易位时产生的电流变化。该技术快速，无需标记和扩增等相关方法，就能够对于检测分析分子的性质进行检测。随之发展起来的纳米孔测序技术可以将人类基因组测序成本控制在1000美元之内。主要介绍了用于单分子分析的纳米孔技术抗结核药物异烟肼的检测新方法。
关键词：溶血素纳米孔;单分子检测;环糊精适配体;异烟肼
1个生物纳米孔
1.1α-溶血素
金黄色葡萄球菌毒素（α-溶血素）是由金黄色葡萄球菌分泌的外毒素。它是研究得最彻底的生物纳米孔，其形状为蘑菇状七聚体跨膜孔蛋白。它主要由两部分组成：一部分是14个跨膜β-螺旋结构链的帽状结构，入口直径为2.6nm，中间直径为3.6nm，前庭长约5nm，另一部分与前庭相连。桶形结构长约5nm，直径为2.2nm，最窄点仅为1.4nm。 α-溶血素自组装在脂质双层膜上形成开放的纳米孔，缓冲液中的阴离子和阳离子通过纳米孔产生开放的离子电流;带电的DNA分子由电压驱动并通过纳米孔产生阻断电流，当DNA分子完全通过時，离子电流恢复正常。由于当前阻断的时间与分子的性质有关，因此DNA分子通过纳米孔的易位事件和DNA分子的性质可以通过当前的变化来研究。由于其孔径小，只允许单链DNA分子通过，因此它只能用于检测较小直径的分析物，如离子[9]，小分子，单链DNA和RNA 。
1.2 MspA
近年来，对耻垢分枝杆菌中孔蛋白MspA生物纳米孔的研究越来越多。
这些结构允许MspA很好地应用于纳米孔测序，特别是具有较短的孔和较小的孔径，允许不同的核苷酸产生更容易区分的通过通道的特征阻断电流。野生型MspA由于其颈部中的负电荷的富集而影响DNA分子的通过，因此通过突变实现负电荷或正电荷的消除，这增加了DNA的捕获速率并降低了DNA穿孔的速率。将突变的MspA蛋白孔与Phi29 DNA聚合酶组合以控制单链DNA分子孔，如分子马达。在聚合酶的作用下，待测DNA分子被消化到孔中，然后返回形成双链，来回。在两个通孔中都发生阻塞效应，并且实现了两个测试，这提高了检测的准确性。
2个固态纳米孔
2.1纳米多孔膜材料
随着纳米孔技术的不断更新，固体纳米孔的制备材料也多样化，主要使用最常见的Si3N4。这主要是由于其化学性质，首先是稳定性，不受电解质浓度和pH的影响。温度的价值和影响;第二，它是绝缘的，在受到高强度电场作用时不会被破坏;它还具有良好的表面特性，有利于纳米孔的表面改性或功能组装[38]。近年来出现的石墨烯纳米孔也是一个研究热点。石墨烯的优异化学，电学和热学性质，特别是单层石墨烯（0.32～0.52nm）的厚度，使纳米孔通道的长度大大缩短。它可以减少DNA分子易位时产生的噪音，并且可以更准确地识别通过DNA分子的物理化学特性，这可以更好地应用于DNA测序。
2.2纳米孔制备方法
与天然纳米多孔材料不同，良好的固态纳米孔装置的制备需要开发各种微纳加工技术。自李等人。 2001年发表了离子束制备纳米孔的方法，报道了各种纳米孔制备方法，包括电子束刻蚀，离子束刻蚀和氦离子刻蚀，电子束收缩和湿法刻蚀。和其他方法。更常见的方法是离子束蚀刻和电子束蚀刻。
2.3纳米电极
基于隧穿电流原理，研究人员开始在孔隙中制备纳米孔，其中集成了纳米电极，用于检测单分子易位事件，同时能够获得横向和纵向的二维电流信号。方向，实现多维度，准确性和检测。灵敏度。由于每个碱基的最高和最低占据分子轨道间隙不同，碱基具有独特的隧穿电流信号，因此可以精确地区分DNA的四个碱基。
3.复合纳米孔
固态纳米孔制备技术相对成熟，但制备较小孔径的纳米孔更加困难。当分析物的物理性质相似时，无法区分它们。在诸如单分子检测的应用中，需要适当地修饰纳米孔的表面以形成复合纳米孔，以提高特定分子的检测灵敏度。例如改变固体纳米孔的尺寸，材料表面的性质（表面电荷，极性）等，使得功能性固体纳米孔可以选择性地输送物质。化学改性，例如烷基，羧基，硫醇改性，可以直接改变材料表面的物理性质，将官能团连接到材料表面。生物分子修饰，例如蛋白质，脂质，核酸等，在固体纳米孔上的一层流动的脂质双层，其区分各种蛋白质分析物并防止α-溶血素纳米颗粒中肽的过度拥挤。孔的β-桶的底部突变形成氨基酸环状结构，环上的半胱氨酸通过二硫键与寡聚DNA结合形成较长的双链DNA的阴离子尾，可以电泳移位。 α-溶血素纳米孔固定固定在固体纳米孔上，实现了生物纳米孔与固体纳米孔的结合，为纳米孔的基因组测序提供了原始芯片。
结束语
纳米孔技术已应用于抗结核药物异烟肼的检测医学等领域，但研究人员仍有一些技术瓶颈需要解决，如随机穿过纳米孔的分子的轨迹控制，分子通过纳米孔的速度。纳米孔和高质量的纳米孔。需要克服批量准备，数据后整理分析和导出等问题。解决了这些问题后，纳米孔测序将实现测序吞吐量的指数级增长，成本控制在1000美元以内的目标即将到来。其快速而廉价的测序能力将引领我们进入比较基因组学分析，疾病诊断和个性化医疗等新领域。
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