蜂产品抗生素残留检测的研究进展

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　　摘要：蜂产品因具有极高的营养价值和药用价值而颇受广大消费者的青睐，然而，抗生素类药物的过量使用或使用不当导致了对人体健康的有害影响，因此必须建立快速准确方法用以检测蜂产品中抗生素残留。综述了蜂产品中抗生素残留的原因、危害，以及微生物学测定法、酶联免疫吸附法、液相色谱法、分光光度法、生物芯片法在蜂产品中抗生素残留检测的应用情况，并展望各种检测技术发展前景和研究方向。
　　关键词：蜂产品；抗生素；残留；检测技术；应用；前景
　　中图分类号：S896.8 文献标志码：A doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2019.05.058
　　Abstract：Bee products are favored by consumers due to their high nutritional value and medicinal value. However，excessive or improper use of antibiotics leads to harmful effects on human health. Therefore，a rapid and accurate method must be established to detect antibiotic residues in bee products. In this paper，the causes and harms of antibiotic residues in bee products and the application of microbiological assay，enzyme-linked immunosorbent assay，liquid chromatography，spectr- ophotometry and biochip assay in the detection of antibiotic residues in bee products were reviewed.
　　Key words：bee products；antibiotics residue；residues；detection methods；application；prospect
　　蜂产品不仅具有很高的营养价值，而且还具有独特的生理和药理功能，因而在食品、医药业、化妆品行业、轻工业、农牧业等行业中的应用日益增多，越来越受到人们的关注。2009年我国蜂产品（含制品）的销售额已达到150亿元，蜂蜜、蜂蜡的出口量均居世界第1位[1-2]。然而，我国蜂产品中抗生素残留的问题尚未得到有效解决，虽然这几年通过无公害蜂产品标准的制定和实施，蜂产品中氯霉素超标问题在出口产品中得到有效控制，但四环素、链霉素、林可霉素、氟甲砜霉素等抗生素的残留现象仍然存在[3]。食用含有抗生素残留超标的蜂产品后，会直接影响人们的身体健康，其危害主要有以下几个方面：过敏性反应、细菌耐药性、环境平衡紊乱或菌群失调、致畸、致突变等。我国在加入世贸组织后，由于蜂产品中抗生素残留超标而导致被外商拒收，这不仅给我国蜂业生产造成巨大经济损失，也严重影响了我国蜂产品在国际市场上的声 誉[4]。介绍了蜂产品中抗生素残留现状及危害，蜂产品中抗生素残留的检测方法，以期为蜂产品中抗生素残留的快速检测及监控提供依据。
　　1 抗生素残留的原因及危害
　　抗生素是指生物在生命活动过程中产生的（或从化学、生物或生化方法中所产生的），并在低微浓度下能选择性地抑制其他微生物的化学物质。据相关研究表明，在养蜂的整个生产过程中，蜜蜂会得很多的病症，其中腐臭病和败血病是常见的病症，当蜜蜂得这些病的时候，就会大大降低蜂蜜的产量，从而影响出口量。所以，养蜂人士为了不让其生病，会加入非常多的抗生素。现今，一些有花苞的农作物被过多喷洒了农药，经过蜜蜂代谢作用，部分蜂产品中残留着抗生素。蜂产品中的药物残留、有害化学物质污染和生物性污染是影响蜂产品安全的主要因素。
　　2 抗生素残留检测技术
　　2.1 微生物学测定法
　　微生物学测定法是目前广泛应用的测定抗生素方法，该方法可以直观地反映抗生素药品的抗菌活性并具有临床特征。同时，微生物法所需仪器设备简单、成本较低。目前，比浊法和琼脂扩散法被列为抗生素微生物检定方法，被我国药典中引用为标准方法，主要有纸片法、管碟法和氯化三苯基四氮唑法。
　　2.1.1 纸片法
　　根据抗生素能抑制微生物生长繁殖的特点而设计。如果蜂产品存在抗生素残留，则其样品提取液可以抑制微生物生长；反之微生物的生长则不会受到抑制，而蜂产品中抗生素残留的多少则可以根据对微生物的抑制程度来判断。王春奕等人[5]用圆盘法对西宁市消毒鲜牛奶中抗生素残留的调查结果表明，检测5批25份市售消毒鲜牛奶中抗生素残留的质量分数在1.5×10-9以上。
　　2.1.2 管碟法
　　根据对抗生素敏感的试验菌在适当条件下所产生的抑菌圈大小和药物浓度成比例的关系设计而成[6]。朱丽云等人[7]采用微生物管碟法与高效液相色谱法 2种方法对蜂蜜中四环素族抗生素的进行检测，分析两者不同的准确度、精确度和灵敏度，结果得到微生物管碟法检测蜂蜜中四环素、土霉素、金霉素线性相关系数分别为0.994 2，0.992 2，0.991 6；回收率分别为80%，81%，78%。高效液相色谱法检测蜂蜜中四环素、土霉素、金霉素线性相关系数分别为 0.999 9，0.999 7，0.999 7；回收率分别为80%，87%，83%。微生物管碟法操作周期长、操作繁琐、误差较大，但是灵敏度高；高效液相色谱法操作简单、测量准确，但是检测金霉素灵敏度没有微生物管碟法的高。
　　2.1.3 氯化三苯基四氮唑法
　　根据抗生素对微生物新陈代谢影响大而设计的。该方法以嗜热链球菌为指示菌，氯化三苯基四氮唑为指示剂（TTC的氧化态无色，还原态为无色），如果蜂产品中没有抗生素存在，则其樣品提取液不影响指示菌的新陈代谢，从而能够使无色氧化态的TTC还原为红色还原态的TTC，培养液从无色变为红色。反之，提取液抑制指示菌的新陈代谢，抑制的程度和抗生素残留量成正比，所以可依据培养液颜色有无变化及颜色变化的深浅来判断样品中抗生素的含量，微生物抑制法通常使用蜡状芽孢杆菌，就检测结果而言，其对四环素类抗生素非常敏感，其中二甲胺四环素的检测限可达到0.001～0.002 mg/L，四环素和土霉素可达到0.025 mg/L，金霉素可达到0.005 mg/L。王婧[8]以发光菌青海弧菌和费氏弧菌为待测菌种，通过固体培养在25 ℃恒温水浴下与待测抗生素反应，分别对磷霉素、甲磺酸左氧氟沙星和土霉素的毒性作用进行检验。研究表明，磷霉素对青海弧菌的抑制率较好，但作用时间短促，量效关系不够理想；甲磺酸左氧氟沙星对费氏弧菌的毒性作用量效果良好，但抑制率浮动较大；土霉素对这2种发光菌的毒性作用量效果关系均较好，对青海弧菌在前20 min低浓度下有毒性兴奋作用，在作用50 min时，量效关系相关性最好；土霉素对费氏弧菌的毒性抑制作用随土霉素浓度变化呈直线关系，且这种关系比较稳定。牛奶中测定时，土霉素对2种菌种的抑制效应有着非常相似的规律，其抑制率随时间的变化都比较稳定，而且费氏弧菌的量效关系更为稳定。因此，费氏弧菌更适合用于检测牛奶中的土霉素。 　　2.2 酶联免疫法
　　酶联免疫法是近年来逐渐应用于检测抗生素残留的方法，其基本原理是通过特定酶对目标物进行标记，底物经过酶催化反应后则显色，最后通过酶标仪测定，该过程较示踪法而言，可以避免放射性物质的污染，以及被标记物衰变过快导致的检测结果不够准确。同时，酶催化反应的专一性很高，反应效率也很高，即催化大量底物只需要短时间内经过微量的酶对其进行催化，因此该方法具有较高灵敏度[9-10]。
　　邢淑婕[11]采用酶联免疫法检测蜂产品中土霉素的残留，采用多克隆抗体作为相应试剂盒，蜂蜜中土霉素的检测范围为5～200 μg/kg，相关系数为0.995 1，在此范围内对人工污染样品的平均回收率为97.5%～ 107.5%；蜂花粉中土霉素的检测范围为50～200 ng/mL，在此范围内对人工污染样品的平均回收率为92.61%～ 104.36%。
　　国占宝等人[12]利用自制的抗四环素单克隆抗体，研制了酶联免疫吸附检测试剂盒用以检测蜂蜜中四环素类抗生素的含量，灵敏度为0.05 ng/mL，检测限为3～5 ng/mL，加标回收率为90%±10%，平均批内和批间变异系数均小于15%。
　　目前，食品分析越来越趋向于简单、快捷、灵敏和微量化。与其他方法相比较，酶联免疫吸附分析法具有高特异性和灵敏性优点。其检测范围在纳克（ng）和皮克（pg）之间，属于超微量分析技术；该方法结果精确、重现性好、成本低、操作简单、样品处理量大[13]。但酶联免疫吸附分析法不可避免地存在一些缺陷，对试剂的选择性高，很难同时分析多种成分；对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应；分析分子量小的化合物或不稳定的化合物有一定的困难。因此，许多学者致力于改进和完善该技术，重点研究多克隆抗体转向单克隆抗体，纯化抗体和抗原，改进抗体的载体、反应环境和定量方式等方面[14]。
　　2.3 液相色谱法及其联用技术
　　高效液相色谱（HPLC）技术是一种分离效率高、分析速度快的方法。近年来，在抗生素残留检测中广泛应用，是一项较为成熟的技术。
　　吴华等人[15]采用高效液相色谱法检测蜂蜜中氯霉素残留，最低检出限为0.01 μg/g，检测线性范围为0.1～10 μg/mL，相关系数R2=0.999 3，加标回收率为82.9%～86.7%，RSD为5.1%～6.0%。该方法解决了一般采用气相色谱-质谱仪（GC-MS）、高效液相色谱串联多级质谱（HPLC-MSN）联用技术检测蜂蜜中氯霉素残留时仪器昂贵、基层单位难以普及的问题。
　　周萍等人[16]利用液-液萃取法结合高效液相色谱-串联质谱检测蜂王浆中的氯霉素残留量，检测线性范围为0.5～20 μg/kg，相关系数R2=0.999 9，检出限为0.1 μg/kg，加标回收率在98.0%～101.3%，相对标准偏差为0.81%～2.08%。该方法简单实用，样品无需经过固相萃取柱即可富集纯化，在质谱仪上可达到与固相萃取相同的检测效果，能很好地检测氯霉素残留量，不产生干扰，使样品前处理的成本大幅度降低。
　　李小平等人[17]采用固相萃取-高效液相色谱荧光法同时测定蜂蜜中5种磺胺类药物的残留。蜂蜜样品经醋酸-醋酸钠缓冲液溶解后，用C18固相萃取小柱富集、净化、乙腈洗脱，从荧光胺中提取5种磺胺类药物，以2%醋酸（V/V）溶液-乙腈（50/50，V/V）为流动相，在C18色谱柱上（250 mm×416 mm，5 μm）分离，荧光法在λEx=405 nm，λEm=495 nm处测定。结果5种磺胺类药物在0.01～0.20 mg/L具有良好的线性，其相关系数均大于0.999 5，加标回收率在82.0%～102.5%，RSD 均小于5.3%，定量检出限为0.004 mg/kg。该方法快速、灵敏、简便、准确，能满足实际工作的需要。
　　相关研究人员建立一种快速液相色谱-串联质譜法同时测定蜂蜜中20种磺胺类药物残留的方法，该方法快速、准确、高效、灵敏。蜂蜜样品采用0.1%（V/V）磷酸提取后，MCX固相萃取小柱净化，快速液相分析色谱柱Shim-pack-XR-ODSII（100 mm×2.0 mm id.，2.2 μm）上，以内含0.1%（V/V）甲酸5 mmol/L乙酸铵的乙腈/水溶液为流动相，采用梯度洗脱。利用超快速液相色谱-三重四极杆串联质谱联用（UFLC-MS/MS）电喷雾电离多反应监测（MRM）正离子模式检测。结果表明，20种磺胺类药物除磺胺胍和磺胺醋酰外均在0.25～25.0 μg/kg范围具有良好的线性关系，磺胺胍和磺胺醋酰在1.0～25.0 μg/kg范围具有良好的线性关系，相关系数> 0.99；在0.5， 2.5，5.0 μg/kg 3个水平添加时，各被测物的回收率在63.3%～106.9%，相对标准偏差（RSD）为1.7%～ 2.3%，检出限为0.004～0.25 μg/kg，最低定量检出限为0.01～0.83 μg/kg。建立的方法可在5.5 min内同时测定20种磺胺，是测定蜂蜜中磺胺类药物残留的一种高效快速的分析方法。
　　侯建波等人建立了固相萃取-液相色谱-质谱/质谱（SPE-LC-MS/MS），同时测定蜂蜜中磺胺类、硝基咪唑类、喹诺酮类、大环内酯类、林可酰胺类、吡喹酮六大类54种药物残留的方法。生产蜜经磷酸盐缓冲溶液稀释、Oasis HLB 固相萃取柱净化后，通过液相色谱-质谱联用技术进行检测（正离子方式，多反应监测模式）。采用同位素稀释内标法或外标法进行定量，线性关系良好，相关系数大于0.992。方法的定量限（LOQ，以信噪比（S/N）大于10计）分别为磺胺类和硝基咪唑类药物1.0 μg/kg，喹诺酮类和林可酰胺类药物2.0 μg/kg，大环内酯类药物3.0 μg/kg，吡喹酮0.3 μg/kg。总体回收率为32.6%～114.0%，相对标准偏差为1.3%～28.9%。该方法的定量限量满足目前国内外药品的最大残留限量的要求，可作为蜂蜜相关药物残留量的筛选检测方法。 　　Kazuhiro Fujita等人从0.01 mol/L Na2edta-mcllvaine缓冲液（pH值4.0）中提取样品，用双苯乙烯二乙苯共聚物柱和铜离子螯合亲和色谱柱对样品进行纯化富集，最后用HPLC荧光检测器进行检测。结果表明，土霉素、正霉素、金霉素的最低检出限分别为0.5，0.7，0.9 ng/g。
　　刘蓉蓉等人采用液相色谱-质谱联用技术，同时测定蜂蜜样品中4种四环素族抗生素和3种差向异构体的方法。采用Edta-mcilvaine缓冲液提取蜂蜜样品中的药物残留。分别用OASIS HLB和羧酸弱阳离子柱固相萃取柱富集纯化，再用流动相洗脱，洗脱液经微孔滤膜过滤，用流动相甲酸水- 乙腈梯度分离，电喷雾- 串联质谱进行测定。在多反应监测模式下，7种药物在22 min内基本实现分离和定性定量。样品在10～500 μg/kg添加范围内，回收率均为64.9%～91.0%，相对标准偏差（RSD）不大于10.5%。土霉素及差向土霉素、四环素及差向四环素的检测限为1 μg/kg，金霉素及差向金霉素、强力霉素的检测限为2 μg/kg。
　　Nozal M J等人用液相色谱-光电二级管检测器-电喷雾电离质谱（LC-DAD-ESI-MS）检测蜂蜜中泰妙菌素的残留，检测限为0.5～1.2 μg/kg。
　　高效液相色谱的特点是在室温下进行分析，特别是对非挥发性及热不稳定性农药的分析优势更为明显，缺点是用于残留物分析的检测器还不十分灵敏，这是因为只有少数农药具有天然荧光，液相色谱-质谱联用技术的出现为农药分析提供了更加便利的条件，使其检测范围加大。高效液相色谱法特异性高、精确度高，但是抗生素的含量少时，不易检测。针对高效液相色谱存在的各种缺陷，联用技术不断推陈出新，是当今蜂产品中抗生素残留检测研究最多、最热门的检测方法。随着我国对食品安全工作的重视及仪器和技术的发展，高效液相色谱在蜂产品药物残留检测中将得到更广泛的应用。
　　2.4 生物芯片检测技术
　　生物芯片即生物传感器，作为一种新型检测技术，其操作方便、快速准确，可以重复使用和连续使用，在单一芯片中完成从样本的预处理、分离、稀释、混合、化学反应、检测到产物提取的全过程，大大提高了检测速度和分析效率。
　　生物芯片检测技术是国际分析领域前沿检测技术， 对大量检测样本具有快速、灵敏、准确、抗干扰性、高通量的特点。由瑞典必安科贝尔法斯特研究中心领先研究的生物检测芯片， 被日本贸易商用于蜂蜜进出口检测。因此，该技术的发展可提高我国蜂产品检测技术的灵敏度与快速检测水平，对提升我国出口企业产品和品牌的美誉度有一定帮助。
　　3 结语
　　目前，对蜂产品中抗生素残留检测的方法较多，检测限一般低于最大残留量。色谱法尤其是高效液相色谱法（HPLC）是目前研究药物残留最常用的检测方法，具有高效、快速、灵敏度高等特点，但前处理比较复杂；酶联免疫法经过20多年来的不断改进和发展，同时伴随着单克隆技术的应用和抗体提纯酶制备技术的提高，其特异性与灵敏度也有很大提高，该方法已经广泛应用于检测农兽药和抗生素残留，可在基层实验室进行，并被多国政府部门认可。但该法存在一定的交叉反应，且包被和洗涤2个关键步骤如果操作不当，会降低测定的灵敏度和准确度，不适合做残留确证，而适用于快速筛选。分析技术联用分析范围广、灵敏度高、结果精确可靠，但所需仪器要求高，不易在基层推广，多用于残留确证。
　　2007年初，农业部蜂产品质量监督检验测试中心（北京）对生物芯片检测技术进行了验证试验，认为该技术对抗生素检测具有先进性、实用性和广阔的开拓前景，但现阶段其发展受到很多相关技术的制约，如费用高、技术复杂等，相信随着技术的发展和相关部门的不断投入，各具特色的生物芯片检测技术将是蜂产品中抗生素残留检测的重要工具。
　　蜂蜜被广泛用于食品、医药和保健品工业中。我国近几年的蜂类产品的貿易量主要为28～30×104 t，主要销量往欧盟、美洲、日本等地。目前，蜂产品中氨基糖苷类抗生素的残留阻碍了蜂产品的出口，原因是蜂蜜中氨基糖苷类抗生素容易引起人的障碍性贫血，对于人类的身体健康其实是有着比较大的潜在危害。因此，提高我国蜂蜜残留的检测水平，是保障蜂蜜中残留的氨基糖苷类抗生素符合进出口贸易限量标准的有效手段。
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