注射用银杏叶提取物及其制剂中总银杏酸含量的测定

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　　摘要 目的：建立超高效液相色谱串联三重四极杆质谱测定注射用银杏叶提取物及其制剂中总银杏酸的方法。方法：采用HLB固相萃取净化制剂，Waters Cortecs T3色谱柱（50 mm×2.1 mm，2.7 μm），以甲醇-1%冰醋酸溶液（90∶10）为流动相，在电喷雾离子化负离子模式下，以多反应监测方式（MRM）检测。结果：银杏酸C13：0、C15：1、C17：1在0～50 ng/mL范围内成良好线性关系，相关系数均大于0.999;平均加样回收率为97.3%～115.2%，相对标准偏差（RSD）为0.3%～3.4%;检出限分别为0.03、0.06、0.04 mg/kg。结论：本方法可应用于实际样品的测定。
　　关键词 银杏叶提取物;注射剂;银杏酸C13：0;银杏酸C15：1;银杏酸C17：1;超高效液相色谱-三重四极杆质谱;多重反应监测;固相萃取
　　Determination of Ginkgolic Acids in the Ginkgo Biloba Extract for Injection and its Preparation
　　Sun Jian，Li Limin，Hu Qing，Zhu Yanrong，Mao Xiuhong，Ji Shen
　　（Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China）
　　Abstract Objective：To develop an analytical method for determination of ginkgolic acids in the ginkgo biloba extract for injection and its preparation by ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry.Methods：The preparations were purified by HLB SPE.A chromatographic column，Waters Cortecs T3（50 mm×2.1 mm，2.7 μm），was used with methanol-1% acetic acid（90∶10）as the mobile phase.The ginkgo acids were detected by electrospray ionization mass spectrometry in negative mode with multiple reaction monitoring（MRM）mode.Results：Ginkgo Acid C13：0，C15：1 and C17：1 possessed good linear correlation in the mass concentration range from 0 to 50 ng/mL，with the correlation coefficients more than 0.999.The mean recoveries were in the range of 97.3%-115.2%，and the RSDs were 0.3%-3.4%.The limits of quantification were 0.03，0.06，0.04 mg/kg，respectively.Conclusion：The method could be applied to the analysis of ginkgolic acids in actual samples.
　　Key Words Ginkgo biloba extract; Injection; Ginkgolic acid C13：0; Ginkgolic acid C15：1; Ginkgolic acid C17：1; Ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Multiple reaction monitor; Solid-phase extraction
　　中圖分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.006
　　银杏叶提取物为银杏科植物银杏的干燥叶经加工制成的提取物，其主要功效为活血化瘀通络。其注射剂多用于改善微血管循环、治疗缺血性心脑血管疾病等。
　　银杏酸是银杏叶提取物中最主要的毒性物质，具有潜在的致敏、致突变作用和强烈的细胞毒性作用[1-2]。银杏酸是6-烷基或6-烯基水杨酸的衍生物，主要包括银杏酸C13：0、C15：0、C15：1、C17：1、C17：2，化学结构见图1。其中C13：0、C15：1、C17：1占总银杏酸的94%以上[3]。《中华人民共和国药典》2015年版[4]规定银杏叶提取物中总银杏酸含量不得过百万分之十。美国药典和欧洲药典以3种银杏酸含量之和作为总银杏酸含量[5]，规定总银杏酸含量不得过百万分之五。而注射剂作为高风险剂型，应当更加严格控制其含量。
　　目前，文献[6-10]多采用HPLC法测定银杏叶提取物中总银杏酸含量，但受限于该方法的灵敏度，检出限已接近百万分之十的限度，不能满足更加严格的限量控制要求。为提高灵敏度和专属性，亦有文献采用LC/MS法[11]、GC/MS法[12]、二维液相色谱法[13]等。
　　作者团队近年来已针对多种基质开发了UHPLC/MS/MS法测定其中总银杏酸含量（3种主要银杏酸C13：0、C15：1、C17：1总量）[14-15]。因注射用银杏叶提取物更加严格的限量控制（不得过百万分之二），且其制剂杏芎氯化钠注射液中银杏叶提取物含量极低（约110 μg/mL）、基质复杂（磷酸川芎嗪、氯化钠等辅料），目前缺乏相关研究。本文建立了UHPLC-MS/MS法解决灵敏度问题，采用的固相萃取前处理技术解决制剂纯化富集的问题。 　　1 仪器与试药
　　1.1 仪器
　　Agilent 1290超高效液相色谱仪;Agilent 6495三重四极杆质谱;Waters Cortecs T3色谱柱（50 mm×2.1 mm，2.7 μm）;Waters Oasis HLB固相萃取柱（规格：1 g/20 mL）。
　　1.2 试剂
　　银杏酸C13：0对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111690-200501）、银杏酸C15：1对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111762-200601），银杏酸C17：1对照品（同田生化公司，纯度98.0%，批号：16040916）;甲醇、乙腈、醋酸、甲酸均为色谱纯。
　　1.3 分析样品
　　10批注射用银杏叶提取物和3批杏芎氯化钠注射液均为生产企业弘和制药有限公司提供。
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱质谱条件 采用Waters Cortecs T3色谱柱（50 mm×2.1 mm，2.7 μm），以甲醇-1%冰醋酸溶液（90∶10）为流动相，待测成分全部出峰后以甲醇-1%冰醋酸溶液（99∶1）充分清洗至少10倍柱体积;对照品溶液及提取物供试品溶液进样量1 μL，注射液进样量5 μL。
　　电喷雾离子化（ESI）负离子模式;干燥气（N2）流速15 L/min，温度225 ℃;雾化气（N2）0.21 MPa;鞘气（N2）流速11 L/min，温度300 ℃;毛细管电压3 000 V。采用多反应监测方式（MRM）检测，监测离子、碰撞能量等参数见表1。
　　2.2 对照品溶液的制备 分别取银杏酸C13：0对照品、银杏酸C15：1对照品、银杏酸C17：1对照品适量，精密称定，加甲醇制成各含50 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL、0 ng/mL的系列混合溶液，作為对照品溶液。
　　2.3 供试品溶液的制备 1）注射用银杏叶提取物：取本品粉末约0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，称定重量，超声（功率180 W，频率42 kHz）20 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。2）杏芎氯化钠注射液：精密量取样品1 000 mL，上Waters oasis HLB固相萃取柱（规格：1 g/20 cc，预先依次用10 mL甲醇和10 mL水活化）上，用80%甲醇10 mL清洗，弃去洗液，再用甲醇20 mL洗脱，收集洗脱液并定容至25 mL，滤过，取续滤液，即得。
　　2.4 专属性试验 取注射液空白样品（缺银杏叶提取物），同2.3 2）制备空白溶液，进样测定，结果空白无干扰。
　　2.5 线性关系考察 分别取银杏酸C13：0对照品、银杏酸C15：1对照品、银杏酸C17：1对照品适量，精密称定，加甲醇制成50 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL、0 ng/mL的系列混合溶液，作为对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液1 μL，注入液相质谱仪，记录峰面积，以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果表明，各银杏酸线性关系良好。见表2。
　　2.6 中间精密度试验 为考察随机变动因素对精密度的影响，按照拟订的方法，由不同的分析人员在不同的日期、不同仪器设备对3批样品进行了含量测定。结果表明，由不同的分析人员在不同的日期、不同仪器设备上测得的结果基本一致，方法的中间精密度良好。见表3。
　　2.7 供试品溶液稳定性试验 取供试品溶液，分别于制备好后放置0 h、12 h、21 h时进样测定。结果表明，银杏酸C13：0、C15：1和C17：1的峰面积RSD分别为8.2%、5.2%和6.2%，基本稳定。
　　2.8 重复性试验 取注射用银杏叶提取物，一式6份，制备6份供试品溶液，进样测定，记录峰面积，计算峰面积/称样量，结果表明，方法的重复性良好。见表4。
　　2.9 回收率试验 取注射用银杏叶提取物（经检测银杏酸C13：0含量0.058 mg/kg，银杏酸C15：1含量0.076 mg/kg，银杏酸C17：1含量0.083 mg/kg），研细，取约0.4 g，一式九份，精密称定，以三份为一组，分别添加低（0.125 mg/kg）、中（0.625 mg/kg）、高（1.25 mg/kg）3个水平的对照品溶液，每个水平做3个平行样，共9份，按上述2.3供试品溶液的制备方法1）和2.1色谱质谱条件进行分析。
　　精密量取杏芎氯化钠注射液（经检测银杏酸C13：0含量4 ng/L，银杏酸C15：1含量5 ng/L，银杏酸C17：1含量8 ng/L）1 000 mL，一式6份，添加0.1 μg/L水平的对照品溶液，按上述2.3供试品溶液的制备方法2）和2.1色谱质谱条件进行分析。
　　结果表明，加样回收率良好，方法准确度高。见表5。
　　2.10 检出限 三重四极杆质谱因其高度专属性，噪声较低，以信噪比计算检出限结果易失真。因此本文以供试品溶液多级稀释，以实际检出浓度作为检出限。结果银杏酸C13：0、C15：1和C17：1的检出限分别为0.03 mg/kg、0.06 mg/kg和0.04 mg/kg，满足总银杏酸百分之二的限度检查要求。
　　2.11 样品测定结果 对企业提供的10批注射用银杏叶提取物和3批杏芎氯化钠注射液进行测定，银杏酸MRM色谱图见图2，结果见表6和表7，均符合原料百万分之二的限度要求。 　　3 讨论
　　3.1 检测指标 银杏酸主要包括5个成分，中华人民共和国药典2015年版一部银杏叶提取物总银杏酸检查项即以银杏酸C13：0（白果新酸）的校正因子一测多评5种银杏酸含量。但以LC-MS/MS法测定总银杏酸含量，无法使用一测多评法，需使用标准品外标法定量。目前银杏酸C15：0、C17：2对照品不易获得，样品中含量很低，且银杏酸C17：2结构中含2个双键，顺反异构体较多，目前尚未研究透彻。且3种银杏酸已占银杏酸总量的94%以上，美国药典即以该3种银杏酸含量之和作为总银杏酸含量，欧洲药典以银杏酸C17：1的校正因子一测多评3种银杏酸含量。故本方法以外标法测定3种含量较高的银杏酸（C13：0、C15：1、C17：1），足以表征银杏酸总量。
　　3.2 流动相的选择 比较1%冰醋酸溶液、0.1%冰醋酸溶液、5 mmol/L乙酸铵溶液和5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%氨水）4种水相流动相对于银杏酸质谱响应的影响，发现5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%氨水）为水相时，响应最高，但色譜保留和峰形均较差，易导致定量准确性差。1%冰醋酸溶液为水相时，色谱分离度、峰形均较好，且响应能够满足灵敏度需要。
　　银杏酸C17：1结构中有一个双键，存在2种顺反异构体，未完全分离，峰形稍差。因本方法为测定银杏酸总量，且中华人民共和国药典HPLC法同样未将该顺反异构体完全分离，故参照中华人民共和国药典2010年版确定甲醇-1%冰醋酸溶液（90∶10）为流动相。
　　3.3 基质效应 色谱中共馏出组分未对待测银杏酸产生基质效应;但样品中存在部分保留极强残留于色谱柱中的成分，与后续样品共馏出产生基质增强效应，可使银杏酸C17：1增强3倍以上。因此待银杏酸全部出峰后以甲醇-1%冰醋酸溶液（99∶1）充分清洗色谱峰至少10倍柱体积，避免基质效应。
　　3.4 制剂采用固相萃取前处理的必要性 杏芎氯化钠注射液处方中包括磷酸川芎嗪、银杏叶提取物、氯化钠。如直接进样，磷酸川芎嗪含量过高，可能污染仪器，并产生基质效应，而氯化钠为非挥发性盐，对仪器产生永久性伤害。另按处方量折算，需取样1 000 mL，方可满足检测灵敏度要求。因此样品必须经富集纯化后方能进样测定。因银杏酸在反相色谱中保留较强，故采用HLB固相萃取柱分离基质与银杏酸。
　　3.5 制剂与原料银杏酸含量比较 通过测定3批银杏叶提取物及对应批次的注射液，测定结果表明，制剂中总银杏酸含量与对应批次的提取物含量基本一致，制剂工艺未影响总银杏酸含量。见表8。因此，控制好原料中的银杏酸含量对于本品安全性尤为重要，而银杏叶提取物制法中的大孔吸附树脂净化是其中的关键步骤，必须加以严格控制。
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