β-1,3-葡聚糖对红螯螯虾血细胞的免疫刺激作用

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　　摘要：【目的】明确β-1，3-葡聚糖对红螯螯虾血细胞免疫力的影响，为开发β-1，3-葡聚糖作为红螯螯虾饲料免疫增强剂提供理论依据。【方法】向红螯螯虾注射不同剂量（1和5 ?g/g）的β-1，3-葡聚糖，以注射生理盐水为对照，于注射后的0、6、12、24和48 h采集红螯螯虾的血淋巴，测定血细胞总数（THC）、活性氧（ROS）含量、一氧化氮（NO）含量、非特异性酯酶活力、吞噬活力及血清酚氧化酶（PO）活力。【结果】β-1，3-葡聚糖可刺激红螯螯虾血细胞THC、ROS和NO含量、酯酶和血清PO活力显著提高（P<0.05，下同），注射5 ?g/g的β-1，3-葡聚糖剂量还可显著提高血细胞的吞噬活力;β-1，3-葡聚糖对各类免疫应答的影响存在一定的剂量和时间效应，THC、ROS含量、NO含量及血清PO活力对β-1，3-葡聚糖的刺激更敏感;ROS含量、酯酶活力和血清PO活力呈先上升后下降的变化趋势，其指标达峰值时，处理时间在24.72～28.20 h范围内。【结论】注射β-1，3-葡聚糖能提高红螯螯虾的循环血细胞数量及其细胞免疫力，表明β-1，3-葡聚糖可开发为红螯螯虾饲料免疫增强添加剂。
　　关键词： 红螯螯虾;β-1，3-葡聚糖;血细胞;免疫刺激;流式细胞术
　　中图分类号： S968.22                     文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）04-0883-08
　　Abstract：【Objective】Effects of β-1，3-glucan injection on immunity of haemocytes of Cherax quadricarinatus were studied. It provided reference for developing β-1，3-glucan as an  immunopotentiator for C. quadricarinatus. 【Method】C. quadricarinatus were injected with different doses（1 and 5 ?g/g） of β-1，3-glucan， physiological saline injection was as control， and haemolymph of C. quadrciarinatus were obtained after 0， 6， 12， 24 and 48 h injection， and then total haemocyte count（THC）， reactive oxygen species（ROS） production， nitric oxide（NO） production， non-specific esterase activity， phagocytic activity and plasmic phenoloxidase（PO） activity of haemocytes were determined. 【Result】β-1，3-glucan injection would significantly induce the improvements of THC， ROS and NO productions， activities of esterase and plasmic PO（P<0.05， the same below）. Moreover， β-1，3-glucan at dose of 5 ?g/g also significantly induced the phagocytic activity of haemocytes. Effects of β-1，3-glucan on immune responses of C. quadricarinatus haemocytes were dose-dependent and time-dependent. THC， ROS and NO productions and plasmic PO activity were more sensitive to β-1，3-glucan stimulation. ROS production， activities of esterase and plasmic PO rose firstly and then dropped. The elapsed time was between 24.72-28.20 h when these three indicators reached their peaks. 【Conclusion】β-1，3-glucan injection can increase the number of circulating haemocytes and improve their cellular immunity of C. quadricarinatus， indicating that β-1，3-glucan can be developed to be an immunopotentiator for C. quadricarinatus.
　　Key words： Cherax quadricarinatus; β-1，3-glucan; haemocyte; immunostimulation; flow cytometry
　　0 引言
　　【研究意義】红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）原产于澳大利亚，20世纪90年代开始引入我国试养，因其出苗量少、虾苗价格贵等原因，尚未得到大规模推广养殖，而逐渐淡出了我国的水产养殖业。近年来，由于对虾病害频发、养成率低下，而红螯螯虾因出肉率高、生长快、适应性强、味道鲜美等优点，成为部分养殖户的替代养殖品种。目前红螯螯虾的人工养殖技术仍处于起步阶段，急需营养饲料、病害防控等研究成果为其规模化发展提供技术支撑。水产养殖动物病害频发是导致养殖失败的主要原因，因此，研制适宜的免疫增强剂，安全高效地提高水产动物自身的免疫力和抗病力，从而减少用药，对生产无毒害残留的优质水产品具有重要现实意义。【前人研究进展】β-1，3-葡聚糖是目前公认的在众多水产动物上具有显著作用的免疫刺激剂（王超和王敏奇，2010;王银东和何吉祥，2014;刘露等，2017）。饲料添加β-1，3-葡聚糖能显著提高凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的过氧化氢酶（CAT）活力、溶菌酶活力、酚氧化酶（PO）活力等非特异性免疫功能（刘立鹤等，2005;杨福刚等，2005;赵红霞等，2010）。饲料中添加400和600 mg/kg的β-1，3-葡聚糖能显著提高花鲈（Lateolabrax japonicus）的抗氨氮胁迫能力（吴春玉等，2013）。在原代培养的凡纳滨对虾血细胞培养液中添加β-1，3-葡聚糖或其衍生物，均能显著提高PO活力和呼吸爆发活力（白楠等，2014）。此外，在饲料中添加0.2% β-1，3-葡聚糖可提高虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的生长性能并改变其部分血液生理指标（王艺等，2018）;向大黄鱼（Larimichthys crocea）腹腔注射浓度5 mg/kg的β-1，3-葡聚糖0.1 mL，可显著降低低氧胁迫下的丙二醛（MDA）含量，提高抗氧化酶的活力与基因表达水平（王永红等，2018）。【本研究切入点】目前以注射β-1，3-葡聚糖的试验方式，并通过细胞学检测方法流式细胞术（Flow cytometry，FCM）分析血细胞免疫响应的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】通过分析β-1，3-葡聚糖注射对红螯螯虾血细胞免疫功能的影响，探讨β-1，3-葡聚糖作为红螯螯虾免疫增强剂的可行性，为开发红螯螯虾的安全高效饲料免疫增强剂提供参考依据。 　　1 材料与方法
　　1. 1 试验材料
　　红螯螯虾购自广州市黄沙水产交易市场，平均体重19.41±3.54 g/尾，在广东省水产健康安全养殖重点实验室室内环境条件下进行暂养。养殖水体环境条件：pH 7.9～8.0，温度（24±2）℃，一直保持曝气，并进行循环过滤。暂养适应一周后，选取健康无病患、附肢完整、处于蜕皮间期的螯虾进行试验。β- 1，3-葡聚糖、SYBR Green I、DCFH-DA、DAF-FM DA和二乙酸荧光素（FDA）均购自Sigma公司，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自Invitrogen公司，其他试剂均为国产分析纯。
　　1. 2 试验设计
　　1. 2. 1 β-1，3-葡聚糖注射 β-1，3-葡聚糖以生理盐水（0.85% NaCl）配制成浓度为1和5 ?g/g的工作液。试验用红螯螯虾分为3组，每组3个平行，每个平行20尾。分别按1和5 ?g/g（以虾体重换算注射量）的剂量进行腹节注射，对照组注射等量生理盐水。
　　1. 2. 2 血细胞悬液制备 于注射后0、6、12、24和48 h分别取样。用2.5 mL一次性注射器吸取600 ?L预冷的抗凝剂（葡萄糖20.5 g/L，柠檬酸钠8 g/L，氯化钠4.2 g/L，pH 7.5），在红螯螯虾的围心腔抽取血淋巴，以预冷的抗凝剂将血淋巴中的细胞浓度调整至1×106个/mL，用于FCM检测。每尾红螯螯虾的血细胞悬液作为一个单独样品进行分析。
　　1. 3 血细胞指标测定
　　1. 3. 1 血细胞总数（Total haemocyte count，THC）
　　各组试验分别取血细胞悬液200 ?L，加入终浓度为10×的SYBR GreenI（原液浓度10000×），室温条件下遮光孵育60 min，再用200目筛网进行过滤后，应用流式细胞仪（品牌BD，型号FACSCalibur）进行检测，根据荧光强度的差异划分完整细胞区域和细胞碎片区域，每个样品上样时间为1 min，分析并记录完整细胞区域的细胞个数，每个样品上样记录3次。THC根据冼健安等（2015）的方法进行计算。
　　1. 3. 2 活性氧（Reactive oxygen species，ROS）含量 以DCFH-DA作为ROS的特异性荧光染料分析ROS含量（冼健安等，2012）。取血细胞悬液200 ?L，加入终浓度为10 ?mol/L的DCFH-DA进行标记，室温条件下遮光孵育30 min，再用200目筛网过滤后上流式细胞仪进行检测，每个样品获取10000个细胞数据。结果以DCF荧光强度（FL1）为横坐标、细胞数量为纵坐标的直方图显示，分析胞内DCF平均荧光强度，胞内DCF平均荧光强度与ROS含量呈正比。
　　1. 3. 3 一氧化氮（NO）含量 以DAF-FM DA作为NO的特异性荧光染料分析NO含量（Xian et al.，2013）。取血细胞悬液200 ?L，加入终浓度为10 ?mol/L的DAF-FM DA进行标记，室温条件下遮光孵育60 min，再用200目筛网过滤后上流式细胞仪进行检测，每个样品获取10000个细胞数据。结果以DAF-FM荧光强度（FL1）为横坐标、细胞数量为纵坐标的直方图显示，分析胞内DAF-FM平均荧光强度，胞内DAF-FM平均荧光强度与NO含量呈正比。
　　1. 3. 4 非特异性酯酶活力 采用FDA作为荧光探针测定非特异性酯酶活力。取血细胞悬液200 ?L，加入终浓度为5 ?mol/L的FDA进行标记，室温条件下遮光孵育30 min，再用200目筛网过滤后上流式细胞仪进行检测，每个样品获取10000个细胞数据。结果以FDA荧光强度（FL1）为横坐标、细胞数量为纵坐标的直方图显示，分析胞内FDA平均荧光强度，胞内FDA平均荧光强度与非特异性酯酶活力呈正比。
　　1. 3. 5 吞噬活力 以人工荧光微球（Fluorospheres? carboxylate-modified microspheres，黄绿色荧光，直径1 ?m，Molecular Probes，Invitrogen）作为被吞噬物。取血细胞悬液400 ?L，加入10 ?L浓度为微球原液1/10的微球稀释液，室温条件下遮光孵育1 h，再用200目筛网过滤后上流式细胞仪进行检测，每个样品获取10000个细胞数据。结果以FL1荧光量为横坐标、细胞数量为纵坐标的直方图显示，吞噬3个或以上荧光微球的血细胞定义为吞噬阳性的细胞，划定该细胞区域，计算该区域细胞比例，即为吞噬率。
　　1. 3. 6 血清PO活力 以L-DOPA为特异性底物测定PO活力（Huang et al.，2010）。分别取30～50 mL血清，与800 mL L-DOPA[用0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH 6.6）配制，磷酸钾缓冲液为38.1 mL 1 mol/L的K2HPO4+61.9 mL 1 mol/L的KH2PO4]充分混合，立刻读取490 nm波长下的光密度值，每10 s读数一次，共读数120 s。以牛血清蛋白为标准蛋白绘制标准曲线，以考马斯亮蓝G-250为染色剂进行染色，在595 nm处比色测定蛋白含量。PO活性单位定义：1 mg蛋白每分钟OD490增加0.001为一个PO活力单位（U/mg）。
　　1. 4 统计分析
　　试验数据利用SPSS 18.0进行单因素方差分析和二次曲线回归分析。
　　2 结果与分析
　　2. 1 β-1，3-葡聚糖注射對红螯螯虾THC的影响
　　由图1可知，红螯螯虾的初始THC为8.85×106个/mL;葡聚糖注射剂量为1 ?g/g时，与注射生理盐水的对照相比，红螯螯虾的THC在注射β-1，3-葡聚糖后6和12 h均表现出显著升高趋势（P<0.05，下同），随后恢复至正常水平;葡聚糖注射剂量为5 ?g/g时，红螯螯虾的THC在注射后48 h内均显著高于对照，最高值出现在注射后6 h，达16.33×106个/mL。 　　2. 2 β-1，3-葡聚糖注射对红螯螯虾血细胞ROS含量的影响
　　由图2可知，葡聚糖注射剂量为1 ?g/g时，红螯螯虾血细胞的ROS含量在注射后6和12 h显著提高，注射后24 h降回到正常水平;葡聚糖注射剂量为5 ?g/g时，红螯螯虾血细胞的ROS含量在注射后48 h内均显著高于对照，最高值出现在注射后12 h，约为对照的3.55倍。可见，在5 ?g/g的葡聚糖注射剂量下，红螯螯虾血细胞的ROS含量呈现明显的先升高后下降变化趋势，对该剂量下的处理时间与ROS含量变化进行二次曲线回归分析，得出ROS含量达峰值时的处理时间为24.72 h（图3）。
　　2. 3 β-1，3-葡聚糖注射对红螯螯虾血细胞NO含量的影响
　　由图4可看出，葡聚糖注射剂量为1 ?g/g时，红螯螯虾血细胞的NO含量在注射后6 h急剧升高，约为对照的2.22倍，在注射12 h后逐渐恢复至正常水平;葡聚糖注射剂量为5 ?g/g时，红螯螯虾血细胞的NO含量在注射后6 h急剧升高至最高值，约为对照的2.68倍，在注射后12 h开始急剧下降，但仍高于对照，注射后24 h恢复至正常水平。
　　2. 4 β-1，3-葡聚糖注射对红螯螯虾血细胞非特异性酯酶活力的影响
　　由图5可看出，葡聚糖注射剂量为1 ?g/g时，红螯螯虾血细胞的酯酶活力在注射后12和24 h显著升高，在注射后48 h下降至正常水平;葡聚糖注射剂量为5 ?g/g时，红螯螯虾血细胞的酯酶活力在注射后12～48 h显著高于对照，在12 h时达最高值。可见，酯酶活力呈现明显的先升高后下降变化趋势，经二次回归分析得出，注射1和5 ?g/g葡聚糖时，螯虾血细胞酯酶活力达峰值的处理时间分别为26.45和26.88 h（图6）。
　　2. 5 β-1，3-葡聚糖注射对红螯螯虾血细胞吞噬活力的影响
　　由图7可看出，在整个试验过程中，注射1 ?g/g葡聚糖对红螯螯虾血细胞吞噬活力无显著影响（P>0.05）;葡聚糖注射剂量为5 ?g/g时，血细胞吞噬活力在注射后6和12 h显著提高，并在注射后12 h达最高值，吞噬率为32.6%。
　　2. 6 β-1，3-葡聚糖注射对红螯螯虾血清PO活力的影响
　　由图8可看出，葡聚糖注射剂量为1 ?g/g时，红螯螯虾血清PO活力在注射后6和12 h显著高于对照，在注射后24和48 h恢复至正常水平;葡聚糖注射剂量为5 ?g/g时，血清PO活力在整个试验过程中均显著高于对照，最高值出现在注射后24 h。在注射5 ?g/g葡聚糖的处理下，血清PO活力呈明显的先升高后下降变化趋势，以处理时间与血清PO活力变化进行二次回归分析，得出血清PO活力达峰值时的处理时间为28.20 h（图9）。
　　3 讨论
　　3. 1 β-1，3-葡聚糖对虾类THC的影响
　　虾类的免疫防御依赖于其先天性免疫，血细胞在细胞免疫和体液免疫过程中均扮演着重要角色（Johansson et al.，2000），因此，THC常作为衡量虾类免疫状态的重要指标。环境胁迫（Cheng and Chen，2001;Xian et al.，2010）、病原体感染（Li et al.，2008;Ji et al.，2009;Xian et al.，2016）等因素均会导致循环血细胞数量的减少，THC下降是免疫力和抗病力低下的一个重要体现。β-1，3-葡聚糖是水产配合饲料中较常用、免疫刺激效果较显著的一种饲料添加剂（王银东和何吉祥，2014）。在饲料中添加β-1，3-葡聚糖可显著提高对虾的THC，从而提高其免疫力和抗病力。我国对虾（Penaeus chinensis）的相关研究显示，注射β-1，3-葡聚糖48 h后，对虾的THC提高了52.0%（汪小锋等，2005）。本研究对红螯螯虾进行β-1，3-葡聚糖肌肉注射，结果显示其THC显著升高，且存在一定的剂量效应。当注射剂量为1 ?g/g时，THC在注射后6～12 h显著提高，随后恢复至正常水平;当注射剂量为5 ?g/g时，THC在整个试验阶段均呈现显著升高，持续时间更长。注射β-1，3-葡聚糖后，THC最高值均出现在注射后6 h，表明THC对β-1，3-葡聚糖注射刺激十分敏感。THC最高值也呈一定的剂量效应，注射剂量为1 ?g/g时，THC最高值是对照的1.45倍;注射剂量为5 ?g/g时，THC最高值为对照的1.98倍。可见，β-1，3-葡聚糖的刺激可诱导红螯螯虾循环血细胞数量增加，从而可能对其免疫力和抗病力产生正面影响，因此，β-1，3-葡聚糖具有作为饲料免疫增强剂的开发潜力。
　　3. 2 β-1，3-葡聚糖对虾类血细胞ROS和NO含量的影响
　　ROS包括超氧阴离子（[O][2] ）、过氧化氢（H2O2）和羟自由基（OH·）等，是机体内重要的抗菌杀菌物质（Munoz et al.，2000;Lambert et al.，2007）。NO作為一种主要的活性氮（RNS）分子，在哺乳动物杀灭病原微生物过程中发挥重要作用，近年来在甲壳动物的研究中也发现NO在杀菌机制中产生作用（Raman et al.，2008;Yao et al.，2010;Xian et al.，2013）。虾类血细胞经革兰氏阴性菌细胞壁脂多糖（LPS）（Xian et al.，2016）和病毒双链RNA类似物聚肌胞苷酸（poly I∶C）（Xian et al.，2018）刺激，以及在吞噬过程中均会产生大量的ROS和NO（Raman et al.，2008），表明ROS和NO在虾类抗菌和抗病毒过程中具有普遍性作用。凡纳滨对虾原代培养血细胞与β-1，3-葡聚糖及其衍生物孵育后，其血细胞呼吸爆发活力极大提高（白楠等，2014）。在本研究中，注射β-1，3-葡聚糖后红螯螯虾血细胞ROS和NO含量均有显著提高，表明β-1，3-葡聚糖注射刺激了红螯螯虾血细胞呼吸爆发活力的提高。ROS和NO对β-1，3-葡聚糖的响应模式存在一定差异，NO的响应较敏感，最高值出现在注射后6 h，但持续时间较短，随后便逐渐恢复至正常水平，可能是由于NO的另一重要作用是作为信号因子参与机体内许多生理与病理过程，其含量受到严格控制;另一方面，NO本身极不稳定，在胞内很快被代谢为硝酸盐和亚硝酸盐。ROS含量的最高值出现在注射后12 h，持续时间较长，注射高剂量时可持续整个试验过程。综上所述，在β-1，3-葡聚糖免疫刺激下，ROS通路和NO通路均是红螯螯虾血细胞的免疫防御机制，其中ROS通路可能起到更为主要的作用。 　　3. 3 β-1，3-葡聚糖对虾类血细胞酯酶活力和吞噬活力的影响
　　酯酶是溶酶体酶类之一，在血细胞抗菌作用中发挥重要作用。虾类血细胞酯酶活力是一个较敏感的指标，对环境胁迫（Xian et al.，2011）和病原体刺激（Xian et al.，2016，2018）均能作出强烈的响应。饲料添加物对酯酶活力的影响目前仅见关于饲料铜离子的研究，结果显示饲料中添加过量的铜离子会对斑节对虾血细胞酯酶活力产生一定的负面影响，可能是过量铜离子产生的细胞毒性所致（冼健安和王安利，2013）。不同微生物抗原物质对酯酶活力的影响也不同，不管是在离体刺激还是在活体注射的情况下，细菌LPS的刺激均能引起对虾血细胞酯酶活力显著提升（Guo et al.，2013;Xian et al.，2016），但聚肌胞苷酸[poly（I∶C）]处理对虾血细胞酯酶活力的影响甚少（Xian et al.，2018）。本研究结果显示，β-1，3-葡聚糖也能诱导红螯螯虾血细胞酯酶活力显著提高，但其敏感性较ROS和NO低，在注射后12 h才呈显著升高趋势。上述结果表明，虾类免疫系统对不同的微生物抗原物质会产生不同的免疫响应。此外，饲料中添加β-1，3-葡聚糖或酵母细胞壁可显著提高凡纳滨对虾溶菌活力或溶菌酶活力（许国焕等，2003;杨福刚等，2005;赵红霞等，2010），酯酶在这一过程中可能起到一定作用。
　　吞噬功能是虾类血细胞进行抗菌防御的主要免疫功能之一。本研究中，在低剂量β-1，3-葡聚糖处理下，红螯螯虾血细胞的吞噬活力无显著变化;而高剂量β-1，3-葡聚糖处理显示出其对红螯螯虾血细胞吞噬活力的激活作用。罗氏沼虾血细胞经LPS刺激后，其吞噬率显著提高（冼健安等，2011），与本研究结果相似。另有研究表明，各类免疫响应并非单一存在，彼此间可能相互激活，配合发挥免疫防御功能，如活化的酚氧化酶原（proPO）系统组分能激活血细胞的吞噬能力（Johansson et al.，2000），血细胞在吞噬过程中会产生大量的ROS和NO（Raman et al.，2008）。
　　3. 4 β-1，3-葡聚糖对虾类血清PO活力的影响
　　proPO系统是虾类免疫系统的重要组成部分，关于proPO系统的作用机理研究已较深入（孟凡伦等，1999;郭慧等，2013）。proPO系统储存于大颗粒细胞和小颗粒细胞的颗粒中，当有微生物抗原性物质如β-1，3-葡聚糖、脂多糖和肽聚糖等存在时，可被相应模式识别蛋白如β-1，3-葡聚糖结合蛋白（BGBP）、脂肪与β-1，3-葡聚糖结合蛋白（LGBP）等识别并结合，引起颗粒细胞脱颗粒释放proPO系统，proPO被丝氨酸蛋白酶激活为活性PO，PO将酚氧化为醌，再形成黑色素而发挥抗菌杀菌作用（徐海圣和徐步进，2001）。体外孵育、注射或饲喂β-1，3-葡聚糖均能显著提高对虾的血清PO活力（许国焕等，2003;刘立鹤等，2005;汪小锋等，2005;白楠等，2014）。本研究结果也显示，注射β-1，3-葡聚糖能显著提高红螯螯虾的血清PO活力，且具有明显的剂量效应，高剂量β-1，3-葡聚糖刺激下其血清PO活力的提高幅度更大，持续时间也更长。
　　4 结论
　　注射β-1，3-葡聚糖能提高红螯螯虾的循环血细胞数量及其免疫力，表明β-1，3-葡聚糖可开发为红螯螯虾饲料免疫增强添加剂。
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　　（責任编辑 邓慧灵）
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