钙结合蛋白S100B对骨性关节炎模型兔软骨损伤修复中炎性递质表达影响

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　　[摘要]目的探討钙结合蛋白S100B对骨性关节炎（OA）模型兔软骨损伤修复中炎性递质表达的影响及其机制。方法应用膝关节制动法制备兔OA模型。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法分别检测兔关节液中白细胞介素`-1β（IL`-1β）、肿瘤坏死因子`-α（TNF`-α）水平，用Real`-time PCR（RT`-PCR）方法及Western blot法检测兔软骨组织中S100B、成纤维细胞生长因子（FGF2）及成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）的表达。利用小干扰RNA（siRNA）技术，构建S100B的siRNA干扰载体和过表达载体以及FGFR1的siRNA干扰载体，用慢病毒转染方法，将S100B的siRNA干扰载体和过表达载体以及FGFR1的siRNA干扰载体转入人滑膜成纤维细胞内。采用ELISA方法检测各组滑膜成纤维细胞中IL`-1β和TNF`-α水平，用RT`-PCR和Western blot法检测FGF2和FGFR1的表达。结果与对照组比较，模型组兔关节液中IL`-1β、TNF`-α水平显著增加（t=4.042、6.408，P<0.05），兔软骨组织中S100B、FGF2、FGFR1表达显著增加（t=4.091～7.229，P<0.05）。S100B过表达及干扰实验显示，LPS+vehicle control组、LPS+S100B过表达组细胞IL`-1β、TNF`-α水平较空白对照组升高，且LPS+S100B过表达组高于LPS+vehicle control组，差异均有统计学意义（F=32.019、27.377，P<0.05）;而LPS+S100B siRNA组细胞IL`-1β、TNF`-α水平与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。FGFR1拮抗实验显示，LPS+vehicle control组、LPS+S100B过表达组细胞IL`-1β、TNF`-α水平较空白对照组升高，且LPS+S100B过表达组高于LPS+vehicle control组，差异均有统计学意义（F=30.548、20.244，P<0.05）;LPS+S100B过表达+FGFR1 siRNA组细胞IL`-1β、TNF`-α水平虽高于空白对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。LPS+S100B过表达+FGFR1 siRNA组细胞FGF2表达较空白对照组显著升高（F=11.002、13.147，P<0.05），但FGFR1表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论钙结合蛋白S100B能够调节滑膜成纤维细胞炎症反应并可能影响OA软骨损伤修复，其机制可能与激活FGF2/FGFR1信号通路有关。
　　[关键词]钙结合蛋白质类;骨关节炎;软骨，关节;成纤维细胞生长因子;受体，成纤维细胞生长因子;兔
　　[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the effect of calcium binding protein S100B on the expression of inflammatory mediators in the repair of cartilage injury in a rabbit model of osteoarthritis （OA） and its mechanism. MethodsA rabbit model of OA was prepared by knee joint immobilization. Enzyme`-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to determine the levels of interleukin`-1 beta （IL`-1β） and tumor necrosis factor`-alpha （TNF`-α） in the synovial fluid of rabbits; real`-time PCR and Western blot were used to determine the expression of S100B， fibroblast growth factor 2 （FGF2）， and fibroblast growth factor receptor 1 （FGFR1） in the cartilage tissue of rabbits. Small interfering RNA （siRNA） technique was applied to construct the siRNA interfe`-rence vector and over`-expression vector for S100B and the siRNA interference vector for FGFR1， all of which were then transfected into human synovial fibroblasts by lentivirus transfection. ELISA was used to determine the levels of IL`-1β and TNF`-α in synovial fibroblasts in each group， and RT`-PCR and Western blot were used to determine the expression of FGF2 and FGFR1. ResultsCompared with the control group， the model group had significantly increased levels of IL`-1β and TNF`-α in the synovial fluid of rabbits （t=4.042 and 6.408， respectively，P<0.05） as well as significantly increased expression of S100B， FGF2， and FGFR1 in the cartilage tissue of rabbits （t=4.091-7.229，P<0.05）. The over`-expression and interference experiments of S100B revealed the following： compared with the blank control group， the LPS+vehicle control group and the LPS+S100B over`-expression group had signi`-ficantly increased levels of IL`-1β and TNF`-α， with significantly hig`-her levels observed in the LPS+S100B over`-expression group than the LPS+vehicle control group （F=32.019 and 27.377， respectively，P<0.05）， while there were no significant differences in the levels of IL`-1β and TNF`-α between the LPS+S100B siRNA group and the blank control group （P>0.05）. The antagonistic experiment of FGFR1 showed the following： compared with the blank control group， the LPS+vehicle control group and the LPS+S100B over`-expression group had significantly increased levels of IL`-1β and TNF`-α， with significantly higher levels observed in the LPS+S100B over`-expression group than the LPS+vehicle control group （F=30.548 and 20.244， respectively，P<0.05）; while the LPS+S100B over`-expression+FGFR1 siRNA group had higher levels of IL`-1β and TNF`-α than the blank control group， the differences between groups were not significant （P>0.05）. Compared with the blank control group， the LPS+S100B over`-expression+FGFR1 siRNA group had significantly increased expression of FGF2 （F=11.002 and 13.147， respectively，P<0.05）， but the expression of FGFR1 was not significant different between the two groups （P>0.05）.  ConclusionCalcium binding protein S100B can regulate the inflammatory response of synovial fibroblasts and may affect the repair of cartilage injury in OA， which may be related to the FGF2/FGFR1 signaling pathway. 　　[KEY WORDS]calcium`-binding proteins; osteoarthritis; cartilage， articular; fibroblast growth factors; receptors， fibroblast growth factor; rabbits
　　骨性关节炎（OA）是由于关节软骨变性、骨质增生而引起的一种慢性进行性骨关节疾病，其发病机制尚不明确[1`-2]。流行病学资料显示，55岁以上人群OA的发病率为44%～70%，65岁以上人群OA的发病率高达60%～70%[3`-4]。我国目前约有1.5亿OA病人，其中50%～70%的病人急需治疗。所以OA发病机制的研究对于疾病的临床防治具有十分重要的意义。研究结果表明，滑膜炎症反应是OA发病的早期阶段，滑膜炎症反应时关节液中的炎症因子，如白细胞介素`-1β（IL`-1β）、肿瘤坏死因子`-α（TNF`-α）等，能够引起软骨细胞的肥大和细胞外基质的降解，最终导致软骨组织破坏[5`-7];同时，滑膜成纤维细胞（SF）也被激活，SF能够通过释放成纤维细胞生长因子（FGF2）与成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）相互作用，来激活多种信号通路，调节滑膜炎症反应，从而影响软骨损伤修复[8`-9]。S100B是S100钙结合蛋白家族成员之一，研究认为其与细胞的增殖、分化、凋亡密切相关[10`-12]。近年来，S100家族分子与滑膜炎和OA之间的关系越来越受到关注，但是有关S100B在OA發生发展中的作用研究尚不多见。本研究通过检测兔关节炎模型S100B表达的变化，并通过在SF中过表达和干扰S100B的表达，观察其对炎症因子IL`-1β和TNF`-α表达水平及FGF2/FGFR1通路分子表达水平的影响，探讨S100B在OA软骨损伤修复中的作用及其机制。
　　1材料与方法
　　1.1软骨损伤动物模型制备
　　取20只健康成年新西兰兔（购自上海中国科学院实验动物中心），随机分为对照组和模型组。模型组兔右膝关节用管型石膏制动4周，对照组兔不做任何处理。4周后，分别取两组兔的关节液及软骨组织用于后续炎症因子及相关蛋白水平的检测。
　　1.2人SF的分离培养
　　关节镜下取正常人外伤后的膝关节滑膜组织，无菌条件下剪碎，用2 g/L的Ⅱ型胶原蛋白酶消化2 h，2.5 g/L胰蛋白酶消化5 min，胎牛血清终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃去上层液体，加入含体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养液，用100目筛网过滤，调整细胞密度至4×108/L，转移至细胞培养瓶内，置37 ℃、含体积分数0.05 CO2培养箱中培养。隔3 d更换培养液，待细胞生长至85%融合时，用2.5 g/L胰酶消化、传代。收集第3～5代细胞用于后续实验。
　　1.3慢病毒介导人SF中S100B的过表达和干扰
　　将上述培养的细胞用慢病毒实现S100B的过表达和干扰，过表达和干扰S100B、干扰FGFR1及相应对照的慢病毒细胞株购自上海汉恒生物科技有限公司。将细胞接种到6孔板中，待融合度达30%时，按照转染复数（MOI）=50转染慢病毒，转染36 h后，在倒置光学显微镜下观察转染效率。
　　1.4实验分组
　　在S100B过表达及干扰实验中分组如下。空白对照组（A1组）：不做任何处理;LPS+vehicle control组（B1组）：用无序列载体阴性对照慢病毒处理人SF后加20 μg/L的LPS;LPS+S100B过表达组（C1组）：用S100B过表达慢病毒处理人SF后加入20 μg/L的LPS;LPS+S100B siRNA组（D1组）：用S100B干扰慢病毒处理人SF后加入20 μg/L的LPS。在FGFR1拮抗实验中的分组如下。空白对照组（A2组）：不做任何处理;LPS+vehicle control组（B2组）：用无序列载体阴性对照慢病毒处理人SF后加入20 μg/L的LPS;LPS+S100B过表达组（C2组）：用S100B过表达慢病毒处理人SF钙结合蛋白S100B对骨性关节炎模型兔软骨损伤修复中炎性递质表达影响143后加20 μg/L的LPS;LPS+S100B过表达+FGFR1 siRNA组（D2组）：应用S100B过表达以及FGFR1 siRNA慢病毒处理人SF后加20 μg/L的LPS。
　　1.5酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测炎症因子的表达
　　采用ELISA法对兔关节液中和处理后人SF中IL`-1β和TNF`-α的表达水平进行测定。检测采用R&D公司生产的试剂盒，按照说明书进行操作。
　　1.6Real`-time PCR方法检测S100B、FGF2和FGFR1 mRNA的表达
　　用Trizol抽提总RNA。用PrimeScript RT试剂盒（Promega公司）进行逆转录。采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq在ABI 7500扩增仪上进行定量PCR，PCR反应条件如下：94 ℃、4 min，94 ℃、40 s，52 ℃、40 s，72 ℃、40 s，共40个循环。PCR结果分析采用2-△△Ct法。
　　1.7Western blot法检测S100B、FGF2和FGFR1蛋白表达
　　将各组的软骨组织和人SF蛋白用SDS`-PAGE凝胶进行电泳并转至PVDF膜上，然后将PVDF膜以50 g/L的脱脂牛奶封闭，再分别采用anti`-S100、anti`-FGF2以及anti`-FGFR1单克隆抗体进行孵育，以GAPDH单克隆抗体作为内参。采用化学发光法检查蛋白，所获得的蛋白条带采用Image J软件进行定量。
　　1.8统计学方法
　　采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，所得计量资料数据以±s表示，两组比较采用两独立样本t检验;多组比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD`-t检验。 　　2结果
　　2.1两组兔关节液中IL`-1β和TNF`-α水平比较
　　与对照组比较，模型组兔关节液中IL`-1β和TNF`-α表达水平显著增加，差异有统计学意义（t=4.042、6.408，P<0.05）。见表1。
　　2.2两组兔软骨组织中S100B、FGF2和FGFR1表达比较
　　与对照组比较，模型组兔软骨组织中S100B、FGF2和FGFR1的表达均显著增加，差异有统计学意义（t=4.091～7.229，P<0.05）。见表2。
　　2.3过表达和干扰S100B对SF细胞IL`-1β、TNF`-α水平的影响
　　与空白对照组比较，LPS+vehicle control组、LPS+S100B过表达组细胞IL`-1β、TNF`-α水平显著升高，且LPS+S100B过表达组高于LPS+vehicle control组，差异均有显著意义（F=32.019、27.377，P<0.05）;而LPS+S100B siRNA组细胞IL`-1β、TNF`-α水平与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。
　　2.4过表达和干扰S100B对SF细胞中FGF2和FGFR1表达的影响
　　与空白对照组比较，LPS+vehicle control组、LPS+S100B过表达组细胞FGF2、FGFR1的表达显著升高，且LPS+S100B过表达组高于LPS+vehicle control组，差异均有显著意义（F=13.221～19.892，P<0.05）;而LPS+S100B siRNA组细胞FGF2、FGFR1的表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。
　　2.5FGFR1 siRNA对SF细胞IL`-1β、TNF`-α水平的影响
　　与空白对照组比较，LPS+vehicle control组、LPS+S100B过表达组细胞IL`-1β、TNF`-α水平显著升高，且LPS+S100B过表达组高于LPS+vehicle control组，差异均有显著意义（F=30.548、20.244，P<0.05）;LPS+S100B过表达+FGFR1 siRNA组细胞IL`-1β、TNF`-α水平虽高于空白对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表5。
　　2.6FGFR1 siRNA对SF细胞FGF2、FGFR1表达的影响
　　与空白对照组比较，LPS+vehicle control组、LPS+S100B过表达组细胞FGF2、FGFR1的表达显著升高，差异有统计学意义（F=11.002～30.148，P<0.05）;LPS+S100B过表达+FGFR1 siRNA组细胞FGF2的表达较空白对照组也显著升高（F=11.002、13.147，P<0.05），但FGFR1的表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表6。
　　3讨论
　　OA在临床上主要表现为关节疼痛、活动受限和畸形，致残率较高，严重影响病人的生活质量[13]。镇痛、抗炎药物是目前临床治疗OA的主要手段，然而这些药物仅能减轻病人的痛苦，在延缓疾病的进展上作用不大。晚期OA病人需行全关节置换手术，这增加了病人的痛苦和经济负担[14`-15]。因此，探索OA的发病机制，寻找延缓或阻止OA发生、发展的治疗靶点，对于疾病的早期防治至关重要。关节软骨内无血管、淋巴管和神经支配，主要靠关节腔内的滑膜液维持营养，所以损伤后较难修复[4，16]。关节软骨机械磨损后启动了炎症递质介导的关节组织异常重建过程是导致OA的主要原因，该过程主要包括关节软骨细胞凋亡和滑膜组织无菌性炎症两方面[17`-19]。S100B是S100钙结合蛋白家族成员之一，与生物机械力学信号的传递密切相关，尤其在机械磨损导致的软骨细胞凋亡和滑膜组织炎症中发挥重要作用[20`-21]。然而，S100B在OA进展过程中的具体作用以及其下游信号通路尚不明确。
　　既往研究认为，FGF2具有促进软骨细胞增殖和软骨修复的作用[22`-23]。然而也有研究认为，FGF2的促细胞分裂作用并没有致力于软骨细胞的再生，反而参与了软骨基质的降解。WANG等[24]的研究结果表明，FGF2可以通过MEK/ERK 信号通路激活RUNX2，从而上调OA病人关节软骨细胞基质金属蛋白酶`-13（MMP`-13）的表达，促进细胞外基质降解。SCHMAL等[25]研究结果表明，FGF2可降低关节软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白酶含量，导致软骨细胞纤维化。此外，FGF2还能通过ERK1/2、p38、JNK或NF`-κb/Elk`-1等途径刺激关节软骨细胞高表达MMP`-13 [26`-27]。FGFRs属于酪氨酸蛋白激酶家族，是FGFs的受体。一般认为，FGFR1和FGFR3表3过表达和干扰S100B对SF细胞IL`-1β、TNF`-α表达影响（n=5，ρ/ng·L-1，±s）组别IL`-1β TNF`-α A1组10.5±1.775.3±10.2B1组32.7±3.4*174.7±20.3*C1组84.5±7.1*301.5±48.2*D1组15.1±2.178.1±9.9与A1组比较，*F=27.377、32.019，P<0.05。
　　是调节关节软骨代谢的关键受体[28]。而FGFR1和FGFR3 均能够被FGF2 激活。YAN等[29]研究显示，FGFR1信号主要是促进关节软骨细胞的凋亡。本研究以FGF2/FGFR1信号通路为S100B的下游信号通路进行机制研究，通过调节SF细胞中S100B的表达，观察其对FGF、FGFR1、IL`-1β、TNF`-α等的影响，探讨其在关节软骨损伤修复中作用。本文结果显示，软骨损伤模型兔关节软骨组织中S100B、FGF2、FGFR1的表达明显增加，关节液中IL`-1β、TNF`-α水平明显增加。其结果提示S100B、FGF2、FGFR1、IL`-1β和TNF`-α参与了OA软骨损伤修复过程。推测其可能作用机制为：S100B诱导SF分泌FGF2等细胞因子，细胞因子与FGFR1受体结合后激活多种信号通路，调节IL`-1β、TNF`-α等炎性细胞因子的表达，调节滑膜炎症反应，从而参与OA软骨损伤修复。为进一步证实该推测，本研究体外培养SF细胞，通过过表达、干扰S100B和拮抗FGFR1表達，观察其对炎症因子IL`-1β和TNF`-α水平及FGF2/FGFR1通路分子表达水平的影响。结果显示，过表达S100B使FGF2、FGFR1表达和IL`-1β、TNF`-α水平增加，而干扰S100B表达则使FGF2、FGFR1表达以及IL`-1β、TNF`-α水平均降低;过表达S100B同时拮抗FGFR1表达时，FGF2的表达较空白对照组显著增加，而FGFR1和IL`-1β、TNF`-α水平均较空白对照组降低，差异具有统计学意义。说明S100B是通过激活FGF2/FGFR1信号通路上调IL`-1β、TNF`-α表达，从而加剧软骨损伤。所以，干扰S100B或拮抗FGFR1表达能够促进关节软骨损伤修复。 　　综上所述，S100B蛋白能够调节SF细胞炎症反应，进而影响OA软骨损伤修复，其机制可能与激活FGF2/FGFR1信号通路有关。
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