白假丝酵母菌基因分型技术的研究

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　　摘要：白假丝酵母菌是假丝酵母菌性外阴阴道病最常见的致病菌种。对致病菌快速准确地分型在研究其所致的感染性疾病的发病机制及诊治措施中发挥重要作用，并且有利于致病菌的流行病学调查。因此本文就用于白假丝酵母菌研究的基因分型技术作一综述。
　　关键词：真菌;白假丝酵母菌;基因分型
　　中图分类号：R379                                    文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.13.009
　　文章编号：1006-1959（2019）13-0025-04
　　Abstract：Candida albicans is the most common pathogenic strain of Candida vulvovaginal disease. The rapid and accurate classification of pathogenic bacteria plays an important role in the study of the pathogenesis and diagnosis and treatment of infectious diseases caused by it， and is conducive to the epidemiological investigation of pathogenic bacteria. Therefore， this paper reviews the genotyping techniques used for Candida albicans research.
　　Key words：Fungi;Candida albicans;Genotyping
　　假絲酵母菌性外阴阴道病（vulvovaginal candidiasis，VVC）是一种常见的女性生殖器感染性疾病，将近3/4的健康女性在其一生中至少经历过一次该疾病，其中约有5%～10%的女性经历了疾病的反复发作[1];白假丝酵母菌是本病最常见的致病菌种[2]。在微生物感染的研究及诊治过程中，只有明确了病原菌的类型，弄清其感染方式及致病机理，才能采取有效的防控措施，因此首先需要对病原菌进行快速而准确的分型。假丝酵母菌的传统分型方法主要是根据假丝酵母菌的表型特征进行分类，包括形态学分型、药敏分型和血清学分型等。但上述分型方法的分型结果很容易因为待测菌的生长条件发生改变而不同，这就导致其识别力及重复性不高，因而在一定程度上限制了它们在病原菌的研究及流行病学调查过程中的运用[3]。
　　传统分型方法因其自身特点在假丝酵母菌分类学中依然扮演着重要角色，但随着假丝酵母菌新种不断被发现以及研究工作对菌种分型的要求提高，对病原菌的分类就不能仅限于种间水平，还必须深入到亚种，以便能对其进行更精确的研究。白假丝酵母菌亦是如此，只有对其进行更加深入的分型才能更好地了解其相关的致病机制。有越来越多的研究结果发现，不同基因型的VVC致病白假丝酵母菌在抗真菌药物敏感性以及毒力等方面存在着明显差异[4-7]。因此，为了更好地研究白假丝酵母菌的基因多态性与其致病机制之间的相关性，迫切需要一种具有操作简单、分型快速、重复性强及分辨率高等特点，并且在临床及实验室间易于推广使用的假丝酵母菌基因分型方法。本文将对常用于白假丝酵母菌基因分型的方法作一综述。
　　1多位点酶电泳分型
　　多位点酶电泳（multilocus enzyme electrophoresis，MLEE）是选取待测菌的多个特定酶蛋白，对其染色后再进行凝胶电泳，根据蛋白的迁移率来判断菌株之间的差异。蛋白的迁移率受其分子量大小及其所带电荷的影响，酶蛋白迁移率的变化反映了其氨基酸序列的差异，由此可推断编码酶蛋白的DNA序列也存在差异。因此，可根据待测菌株的酶蛋白迁移率不同对其进行基因分型。MLEE的分辨力普通但重复性很好，甚至拥有比许多基于DNA的基因分型技术更好的可重复性。但MLEE至少需评估10个酶才能有效地分辨菌株间的差异，因此操作耗时较长。MLEE的主要缺点是它间接地检测基因组并且评估的是物种中非常缓慢积累的变异。此外，MLEE不能检测菌株之间基因水平的所有差异，因为碱基的变化不一定导致蛋白质的氨基酸发生变化。MLEE是第一种能够有效分析白假丝酵母菌种群遗传多态性的技术，但近年来MLEE正在被基于DNA的更具分辨力的基因分型方法所取代[8]。有学者使用MLEE对分离于VVC患者的白假丝酵母菌进行分型，证实了MLEE具有较好的可重复性及分辨力[9]。Boriollo MF等[10]建议将MLEE联合其他分子分型技术使用，能够更加准确地对菌株的种群遗传结构进行分析。
　　2随机扩增多态性DNA分型
　　随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术以随机排列的寡核苷酸单链（通常不超过10 bp）为引物扩增基因组DNA，引物随机结合靶DNA，导致未知的序列片段被扩增，将扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳分离，再经染色或放射自显影后观察待测DNA条带的数量和位置。RAPD拥有许多优点，比如操作简单、快速以及成本低，并且不需要任何待测DNA的序列信息[11]。虽然RAPD的分辨率一般，但可以通过增加寡核苷酸引物的数量，显著提高其分辨能力。Ying C等[12]用RAPD技术对分离于VVC患者的115株致病白假丝酵母菌进行基因分型，显示出该方法具有较强的分型能力，可以很好地应用于白假丝酵母菌的流行病学研究。尽管RAPD分型技术已成功用于多项临床研究，但其却存在着重复性差的缺点，该问题不仅可能发生在实验室之间，也可能发生在实验室内;实验中的任何操作、相关试剂的用量以及人为因素等都可能会影响扩增的结果。此外，RAPD扩增反应的退火温度较低，通常为35℃～40℃，易出现假带。采用RAPD进行基因分型时常会出现较为复杂的条带图，此时如果利用相关的计算机软件可以有效地降低人工分析时出现的视觉误差。只有建立一致而稳定的优化体系和扩增条件，才能获得较稳定的试验结果，才有可能使RAPD技术的分型结果在不同实验室之间具有可比性。 　　3基于25S rDNA序列的分型
　　此基因分型技术是先提取待测菌株的基因组DNA，同时根据白假丝酵母菌基因组内的25S rDNA序列设计一对特异性引物，然后运用PCR技术对提取的DNA进行扩增，扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳后于紫外灯下观察，根据条带的位置进行分型。该技术使用的引物被设计跨越了25S rRNA基因（rDNA）可转座Ⅰ型内含子位点的区域[13];根据PCR产物分子量的大小将假丝酵母菌分为五种基因型：A基因型（450 bp，没有内含子）;B基因型（840 bp）;C基因型（450 bp和840 bp）：可看作是菌株在从A基因型到B基因型或B基因型到A基因型的转变期间出现的中间形态，或者是A基因型和B基因型有性生殖的结果;D基因型（1080 bp）：为都柏林假丝酵母菌，其表型与白假丝酵母菌相似;基因型E（1400 bp）：分离自免疫缺陷患者[14]。
　　目前认为这种以内含子为基础的PCR基因分型技术是研究白假丝酵母菌流行病学和分类学简单可行的方法[15]。国内外很多学者都开始运用此方法研究白假丝酵母菌基因型与其致病力及药物敏感性间的相关性[4，15-19]。Zhang X等[18]用该方法对876株VVC致病白假丝酵母菌进行分型，研究不同基因型白假丝酵母菌的抗真菌药物敏感性差异，结果提示白假丝酵母菌25SrDNA中可转座Ⅰ型内含子的存在可能对影响伊曲康唑、氟康唑和制霉菌素的敏感性具有重要意义。该基因分型方法简单且重复性很好，但它的分辨率较低，使其在流行病学研究中受到限制;Dalvand A等[20]通过将此方法联合基于ALT序列的PCR技术，很好地提高了分辨率。
　　4重复序列聚合酶链反应分型
　　重复序列聚合酶链反应（repetitive sequence-based PCR，REP-PCR）分型技术是针对目的基因非编码区高度保守的重复序列设计引物，然后对特定序列进行PCR扩增，通过对PCR產物电泳图谱的分析，比较菌株间基因组存在的差异，是一种基因组指纹分析方法。REP-PCR技术是一种简单快速、灵敏可靠且低成本的方法，可用于大量样品[21]，并且普遍运用于临床病原菌的分型中。但是，REP-PCR技术的重复性受很多因素的影响，如实验过程中使用的试剂和仪器以及人为操作因素等。基于REP-PCR原理的Diversi Lab[22]自动化分型系统近年来被逐渐运用，其为完成不同菌株之间的同源性分析提供标准化的、可重复的DNA指纹图谱，从核酸提取到获取分析报告仅需约4 h，操作步骤简便，并且使REP-PCR分型结果更精确，使不同实验室之间的结果具备了可比性。
　　5微卫星长度多态性分型
　　微卫星序列是由2～6个核苷酸组成的串联重复序列。微卫星长度多态性（microsatellite length polymorphic，MLP）根据微卫星区侧翼的单一序列设计引物，用荧光标记的引物对微卫星序列进行扩增，扩增产物经凝胶电泳后再对电泳结果进行分析，根据微卫星基序重复数目的差异进行基因分型。MLP是白假丝酵母菌基因分型中分辨率最高的方法之一，然而其分辨率受所使用的微卫星标记影响，多个标记组合分析可以更准确地对待测菌株进行分型，分辨率也更高[23]。我国学者运用MLP技术对208株VVC致病白假丝酵母菌进行分型，检测到了51个基因型，结果显示出致病菌独特的基因型分布[24]。MLP还具有高通量、自动化、重复性好的优势，但MLP的固有缺点包括专用设备的高成本和在常规使用中实施该技术的困难，特别是在发展中国家。为克服这一困难，Li J等[25]联合微卫星标记物CAI和单链构象多态性（SSCP）对白假丝酵母菌进行分型，分辨率可达0.993，同时是白假丝酵母菌快速菌株分型有效且经济的方法，易于推广运用。此外，MLP技术因为不同实验室之间使用的设备差异比较大，使其分型数据不便于互相交流;因此有学者开发了等位基因CDC3阶梯，以促进白假丝酵母菌MLP基因分型数据在不同实验室之间的交流[26]。
　　6多位点序列分型
　　多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）采用PCR技术扩增多个管家基因的核苷酸序列，然后进行DNA测序，通过分析管家基因序列的差异，对待测菌株进行基因分型。Bougnoux ME等首先提出了白假丝酵母菌MLST的标准实验方法，并且创建了白假丝酵母菌的MLST数据库（http：//calbicans.mlst.net/），用于积累和分析全球来源的白假丝酵母菌MLST数据[27]。用MLST对白假丝酵母菌进行基因分型时，仅需对7个管家基因（AAT1a、ACC1、VPS13、MPIb、ADP1、SYA1和ZWF1b）进行扩增测序，然后将测序结果直接输入MLST数据库进行比对分析，即可得到分型结果——菌株的序列型（sequence type，ST） [27]，通过对比待测菌株的ST就能分析不同菌株间的差异及关联。Wu K等[28]证实了MLST是研究白假丝酵母菌微进化及流行病学调查的可靠技术。
　　与其他分型方法相比，MLST的主要优势在于建立了有大型全球公用数据库的国际网站，序列数据可以在不同国家和地区的实验室之间共享，通过因特网可以在世界范围内进行假丝酵母菌的流行病学研究。并且MLST是目前白假丝酵母菌基因分型方法中分辨率最高的方法之一。但是MLST也存在一些不足，首先MLST的分辨力取决于管家基因的变异程度;其次，MLST分析需要进行大量的核酸测序工作，成本过高，耗时较长，这也是限制MLST技术广泛推广的一个因素。
　　综上所述，不同的基因分型方法都有各自的优点和缺点，因此在实际研究中应根据不同的实验目的和具体的条件选择合适的方法，为确保得到更加客观、准确的鉴定和分型结果，可以尝试联合使用多种基因分型技术，并结合传统的分型方法，同时借助计算机软件进行分析。通过基因分型可以准确地显示白假丝酵母菌菌株间的差异性及相似性，从而判断其亲缘性的远近，揭示疾病的传染源，为研究病原菌的致病力及其对抗真菌药物敏感性的差异和临床感染性疾病的诊治提供依据。 　　参考文献：
　　[1]Chew SY，Than LT.Vulvovaginal candidosis：contemporary challenges and the future of prophylactic and therapeutic appro aches[J].Mycoses，2016，59（5）：262-273.
　　[2]Goncalves B，Ferreira C，Alves CT，et al.Vulvovaginal candidiasis：Epidemiology，microbiology and risk factors[J].Crit Rev Microbiol，2016，42（6）：905-927.
　　[3]Bai FY.Association of genotypes with infection types and antifungal susceptibilities in Candida albicans as revealed by recent molecular typing strategies[J].Mycology，2014，5（1）：1-9.
　　[4]祁文瑾，李白鸾，钱源.假丝酵母菌性外阴阴道病不同基因型致病菌株药物敏感性比较[J].中国全科医学，2016，19（2）：233-237.
　　[5]Arslan S，Koc AN，Sekerci AE，et al.Genotypes and virulence factors of Candida species isolated from oralcavities of patients with type 2 diabetes mellitus[J].Turk J Med Sci，2016，46（1）：18-27.
　　[6]Mutlu Sariguzel F，Berk E，Koc AN，et al.Investigation of the relationship between virulence factors and genotype of Candida spp. isolated from blood cultures[J].J Infect Dev Ctries，2015，9（8）：857-864.
　　[7]Sokól I，Gawe A，Bobrek K.Investigation of the correlation between virulence factors and genotypic profiles of Candida albicans isolated from turkeys[J].Pol J Vet Sci，2018，21（1）：29-33.
　　[8]Dadar M，Tiwari R，Karthik K，et al.Candida albicans-Biology，molecular characterization，pathogenicity，and advances in diagnosis and control-An update[J].Microb Pathog，2018，117（2）：128-138.
　　[9]Santos PO，Melo JO，Ponzzes CM，et al.Multilocus enzyme electrophoresis analysis and exoenzymatic activity of Candida albicans strains isolated from women with vaginal candidiasis[J].Mycoses，2012，55（1）：64-72.
　　[10]Boriollo MF，Dias RA，Fiorini JE，et al.Disparity between Multilocus Enzyme Electrophoresis，Microsatellite Markers and Pulsed-Field Gel Elec trophoresis in epidemiological tracking of Candida albicans[J].J Microbiol Methods，2010，82（3）：265-281.
　　[11]Malek M，Paluchowska P，Bogusz B，et al.Molecular characterization of Candida isolates from intensive care unit patients，Krakow，Poland[J].Rev Iberoam Micol，2017，34（1）：10-16.
　　[12]Ying C，Zhang H，Tang Z，et al.Antifungal susceptibility and molecular typing of 115 Candida albicans isolates obtained from vulvova ginal candidiasis patients in 3 Shanghai maternity hospitals[J].Med Mycol，2016，54（4）：394-399.
　　[13]Gurbuz M，Kaleli I.Molecular analysis of Candida albicans isolates from clinical specimens[J].Mycopathologia，2010，169（4）：261-267.
　　[14]張旭，刘朝晖.阴道白假丝酵母菌25SrDNA基因分型与药物敏感性的关系[J].中华妇产科杂志，2016，51（4）：279-284. 　　[15]Tantivitayakul P，Panpradit N，Maudcheingka T，et al.Genotyping of Candida albicans and Candida dubliniensis by 25S rDNA analysis shows association with virulence attributes in oral candidiasis[J].Arch Oral Biol，2019，97（10）：18-24.
　　[16]Manaen Rai Y，Ling K，Qi W.Genotypes and Susceptibility of Candida Species Causing Acute and Recurrent Vulvovaginitis[J].Jundishapur Journal of Microbiology，2017，10（11）.
　　[17]da Silva-Rocha WP，Lemos VL，vidizisnki TI，et al.Candida species distribution， genotyping and virulence factors of Candida albicans isolated from the oral cavity of kidney transplant recipients of two geographic regions of Brazil[J].BMC Oral Health，2014（14）：20.
　　[18]Zhang X，Liu ZH.25S rDNA genotype and antifungal susceptibility of vaginal Candida albicans[J].Chin J Obstet Gynecol，2016，51（4）：279-284.
　　[19]Zida A，Issiaka S，Sanata B，et al.25S rDNA genotype and antifungal susceptibility of clinical Candida albicans in Ouagadougou（Burkina Faso）[J].Med Mycol，2018，56（7）：907-910.
　　[20]Dalvand A，Katiraee F，Jafari Joozani R，et al.Genotyping of Candida albicans isolated from animals using 25S ribosomal DNA and ALT repeats polymorp hism in repetitive sequence[J].Curr Med Mycol，2018，4（4）：12-19.
　　[21]Abaci O，Haliki-Uztan A，Ozturk B，et al.Molecular typing of Candida albicans strains isolated from denture wearers by repetitive sequence-bas ed PCR[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2011，30（2）：141-149.
　　[22]Sasso M，Normand AC，Pantel A，et al.Evaluation of the DiversiLab   automated repetitive sequence-based PCR system for the characterization of Candida albicans and Candida glabrata isolates[J].J Mycol Med，2018，28（2）：320-326.
　　[23]Sharifynia S，Rezaie S，Mohamadnia A，et al.Genetic diversity and antifungal susceptibility of Candida albicans isolated from Iranian patients[J].Med Mycol，2019，57（1）：127-131.
　　[24]Li C，Wang L，Tong H，et al.Microsatellite analysis of genotype distribution patterns of Candida albicans vulvovaginal candidiasi s in Nanjing，China and its association with pregnancy，age and clinical presentation[J].Arch Gynecol Obstet，2016，294（2）：291-297.
　　[25]Li J，Bai FY.Single-strand conformation polymorphism of microsatellite for rapid strain typing of Candida albicans[J].Med Mycol，2007，45（7）：629-635.
　　[26]Alanio A，Desnos-Ollivier M，Garcia-Hermoso D，et al.Investigating Clinical Issues by Genotyping of Medically Important Fungi： Why and How[J].Clin Microbiol Rev，2017，30（3）：671-707.
　　[27]Bougnoux ME，Tavanti A，Bouchier C，et al.Collaborative consensus for optimized multilocus sequence typing of Candida albicans[J].J Clin Microbiol，2003，41（11）：5265-5266.
　　[28]Wu K，Luo T，Li L，et al.Multilocus Sequence Typing of Pathogenic Candida albicans Isolates Collected from a Teaching Hospital in Shanghai，China：A Molecular Epidemiology Study[J].PLoS One，2015，10（4）：e0125245.
　　收稿日期：2019-3-27;修回日期：2019-4-9
　　編辑/张建婷
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