DNA条形码技术在中药材鉴定中的应用

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　　摘要 DNA条形码技术是一种新兴的分子鉴定方法，它能弥补传统化学方法和形态学方法鉴定中药材的不足之处。通过查阅文献，在分析DNA条形码技术的原理、发展的基础上，对目前一些热门的DNA条形码候选序列ITS、ITS2、psbA-trnh、rbcL、matK展开讨论，重点分析其在植物类和动物类中药材鉴定中的应用，为中药材的鉴定提供新的思路。
　　关键词 DNA条形码;中药材;鉴定;应用
　　中图分类号 R282.5文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2020）02-0016-04
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.005
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Application of DNA Barcode Technology in Identification of Chinese Medicinal Materials
　　LI Xiao1，TAN Zhao-yang1，2，XU De-hong1 et al （1.Lab of Bioengineering，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208;2.Lab of Nature and Effectiveness of Chinese Medicine，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208）
　　Abstract DNA barcode technology is an emerging molecular identification method that can make up for the shortcomings of traditional chemical methods and morphological methods to identify Chinese herbal medicines.By consulting the literature，on the basis of analyzing the principle and development of DNA barcode technology，some popular DNA barcode candidate sequences ITS，ITS2，psbA-trnh，rbcL，matK are discussed，focusing on its application in the identification of Chinese herbal medicines in plants and animals，and provided new ideas for the identification of Chinese herbal medicines.
　　Key words DNA barcode;Chinese herbal medicine;Identification;Application
　　市面上的中药材仿冒品和替代品数量不断增多，人为不规范的种植、商家牟利、掺杂造假等种种行为严重危害到了患者的生命安全以及医药相关人员的信誉。因中草药在临床应用上的复杂性，中草药基原混淆、质量不合格容易导致患者发生严重的不良反应。以白鲜皮为例，临床上许多患者由于服用了与植物白鲜相似的伪品中药材加工成的饮片，导致药物性肝损伤[1]。由此可见，中药材的使用不当会损害机体健康甚至引发中毒反应。而许多药材与混伪品之间形态相似，通过传统的理化鉴定方法有较大的难度。因此，有必要建立更加准确、快速、可靠的中药鉴定体系和质量评价体系。
　　1 分子标记技术
　　分子标记是以核苷酸序列变异为基础的遗传标记，表现了DNA水平的遗传多态性[2]。DNA 分子遗传标记技术相比于传统鉴定技术具有快速、微量、特异性强等特点，在中药材鉴定方面已被国内外研究者广泛关注[3-4]。目前一些DNA分子标记的方法也被逐渐应用到中成药的鉴定中，如单核苷酸多态性、限制性片段长度多态性、随机扩增多态性DNA标记、突变等位基因特异性扩增、简单重复序列、SSR分子标记等，各有相应的适用范围。其中简单重复序列促进了中药鉴定技术的发展[5]。SSR分子标记多态性高、重复性强、数量丰富，对基因组有很好的覆盖性[6]，同时SSR分子标记适用于没有详细背景材料的中药材[7]，方便构建中药指纹图谱。而新技术双分子标记法能满足现阶段在分子水平上同时研究中药的种类和质量差异[8]，获取物种完整的遗传信息，弥补单一鉴别方法的不足[9]。DNA條形码技术也属于分子标记技术的范畴，能够快速地识别物种信息，为中药鉴定提供了便利。
　　2 中药材DNA条形码分子鉴定指导原则
　　2.1 DNA条形码的定义及原理
　　加拿大动物学家Paul Hebert T最早提出DNA条形码概念，他通过试验分析对动物界的线粒体编码区基因进行比较，98%的物种的种内变异较低，种间平均变异达11.3%，在昆虫、鱼、鸟类动物中也有很高的鉴别效率[10]。因此，他们将商场用以区分不同商品的条形码概念引入中药鉴定，为每一种不同的中药材构建相应的条形码。通过扫描该条形码，就能快速获得完整的中药材信息，据此提出的使用单一短的基因片段来鉴定物种，把这种小片段基因序列称作物种DNA条形码，并提出为全球编码的计划[11]。DNA条形码是指一段片段较短相对保守的序列，既有一定的保守性不易突变，又存在一定的可变性用来区分近缘物种。DNA条形码技术应用于鉴定中药材，不受物种不同时期生长状态的影响。 　　2.2 DNA条形码技术的发展
　　DNA条形码从基因水平来鉴定不易区分的物种，结果稳定可靠，为道地药材的鉴定与种质资源的筛选提供了新的方法。因此，大量研究人员开始寻找动植物DNA条形码的鉴定标准。高通用性、高效筛选能力成为选择DNA条形码的重要标准之一。早在2003年，提出DNA条形码概念的生物学家Hebert Paul D通过试验研究表明条形码COI序列片段短，通用性好且鉴定效率高[12]。后许多学者认同了这一说法，通过试验比较将大小为650 bp的COI认定为动物通用的条形码序列，并在2008年加拿大的学术会议上引入了超级条形码的概念[13]。动物具有较高的进化速率，因此，动物线粒体COI序列的条形码具有广泛性和通用性。目前在国内，陈士林教授所带领的团队长期从事中药资源的研究工作，应用条形码技术对大量动植物药材进行鉴定，相比于之前药工凭借经验鉴定中药材、区分相似品和易混淆品有良好的效果。植物药材由于生长环境复杂，进化速率低，因此在选择DNA条形码中很少存在单独的条形码片段来滿足各种不同的植物。大量中药材DNA条形码分子是以ITS2为主体的鉴定体系[14]，其中植物类中药材选用ITS2为主体序列，psbA-trnH为补充序列，研究表明ITS2在鉴定大部分植物中均有良好的鉴定效果。psbA-trnH序列适用范围低于ITS2序列，主要用于阙类植物的鉴定[15]。
　　2.3 鉴定方法和流程
　　2.3.1 材料预处理。
　　中药材容易发生降解以及产生醌类有毒物质。因此在提取DNA的过程中需要减小内生菌的污染。常用的方法有加入PVP粉末、在提取DNA前适当用酒精消毒。
　　2.3.2 DNA的提取。
　　高质量的DNA是进行DNA条形码研究的必要前提和关键环节[16]。植物组织中含有大量多糖、多酚等次生代谢产物。CTBA法可以快速提取植物的总DNA。将新鲜的叶片在液氮中研磨，以机械力破碎细胞壁，再加入CTBA使细胞膜破裂，同时将核酸与植物多糖等杂质分开。再经氯仿提取处理去除蛋白，即可得到相应的DNA[17]。
　　植物类的中药材种类繁多，除了CTBA法之外，还可以采取SDS法、高盐低pH法、改良PVP法等[18] 。例如提取菟丝子的DNA，采用4种不同的方法进行提取后，对DNA的浓度和纯度进行检测分析，结果发现改良PVP法提取的DNA得率较高[19]。CTBA法相比于改良PVP法具有快速简便的优点，但DNA的得率低于改良PVP法。因此，应该根据不同的样品、不同的试验需求来选用不同的方法。
　　2.3.3 PCR扩增。对植物提取的DNA进行体外大量复制，通过适宜的条件得到相应的PCR产物。
　　2.3.4 PCR产物纯化与序列拼接。将PCR 扩增条带的样品进行胶回收纯化后，送测序公司进行 DNA 序列测定，最终获得目的片段的双向序列。
　　2.3.5 结果判定。
　　将获得的序列在GenBank数据库用BLAST方法进行结果判定，结果中相似性最高的序列对应的物种为查询序列最接近的物种[20]。通过MAGE软件构建物种的系统发育树，比较物种种内和种间的遗传距离。
　　3 DNA条形码在植物类药材鉴定中的应用
　　3.1 ITS序列和ITS2序列对植物类药材的鉴定
　　ITS序列可使整个基因组内的不同拷贝趋于一致，常用于系统进化研究和物种鉴定[21]。ITS序列位于rRNA处，其中编码区（5.8S，18S，28S）序列高度保守又具有足够的变异，适用于鉴定近缘关系较高的物种。转录间隔区ITS1和ITS2保守能力低于编码区，但也具有一定的鉴别能力，适用于种间差异大的物种。因此ITS序列被认为适用于鉴定植物药材的热门条形码之一。但ITS序列也存在着一些不足之处，核内转录间隔区ITS序列缺少通用引物，导致PCR不易扩增[22]。ITS序列较长，在PCR扩增的过程中发生碱基缺失突变的概率较大，会对试验结果的真实性造成一定的影响。为了弥补ITS序列的不足，通过研究发现ITS2序列PCR扩增效率高且碱基突变率低。ITS2 序列对鉴定材料的要求不高，其序列相比 ITS 序列短，长度仅有300 bp左右，而且在基因组中适合于属、种水平的鉴定[23]。ITS2序列满足了DNA条形码选择序列的标准（ 进化速率快，有足够的变异位点） ，国内外很多学者将ITS2 序列作为鉴别物种的主要条形码，特别是在真菌类物种的鉴别方面[24]。ITS2序列信息量大且相对稳定，在物种水平上变异快，序列位点较多，其中包括变异位点、保守位点、信息位点等，为DNA条形码提供了大量信息[25]。ITS2序列在植物鉴定中越来越受到重视，陈士林等[20]
　　对753属4 800种植物6 600份样品进行研究，得出ITS2序列在种水平的鉴定成功率达92.7%。ITS2序列物种识别率和物种变异率较高，种内变异小而种间变异大，特别适合于在物种水平鉴定中药材。同时ITS2还可自我聚合形成二级结构[26]，通过茎环的形状与数目来区分不同的物种。此外，ITS2对于降解严重的材料也有一定的鉴定能力，因此ITS2的应用更具有广泛性。
　　3.2 psbA-trnH序列对植物类药材的鉴定
　　PsbA-trnH序列对于刺五加科的植物有较好的鉴定能力。通过K2P遗传距离法、相似性搜索算法和构建系统发育树进行分析，结果均显示，基于psbA-trnH序列能直观有效地鉴定竹茹、天竺黄各基原及其近缘物种。竹茹、天竺黄各基原及其近缘物种存在特定的碱基缺失[27-28]，且psbA-trnH序列鉴定兰科植物效率高达90%，但PsbA-trnH序列在鉴别非同属植物上效率较低[29]。因此，psbA-trnH序列通常被认为是鉴定植物的辅助条形码。 　　3.3 其他条形码序列
　　除了ITS序列、ITS2序列和PsbA-trnH序列，matK和rbcL序列也是目前广泛用于鉴定植物的热门条形码序列。matK和rbcL序列均属于片段较长的条形码，rbcL序列适用于区分相似程度小、科以上等级的植物鉴别。如rbcL序列适用于鉴别鸡血藤及其混伪品[30]。matK序列适用于鉴别种间变异较小的兰科类植物[31]，还可单独鉴定植物药材。matK序列在蛋白编码基因中进化速率快[32]。在常用的PCR扩增体系中，matK+ rbcL序列和PsbA-trnH序列可组合使用鉴别[33]。生命条形码联盟植物工作组在2009年审定通过matK和rbcL基因片段为植物的核心条形码， psbA-trnH和ITS基因片段为补充条形码[34]。植物在其进化过程中进化速率低于动物，因此推荐使用组合条形码来鉴别植物药材，共同提高鉴定效率。
　　4 DNA条形码在动物类药材鉴定中的应用
　　DNA条形码技术在鉴定植物药材方面已有大量研究数据，但在动物类药材有关方面的研究较少，对混伪品及濒危名贵动物药材的研究不足[35]。近年来国内外许多学者开始着重于大力推动DNA 条形码鉴定动物类药材的研究进展。动物类中药材主要分布在节肢动物门、脊索动物门、环节动物门、软体动物门、棘皮动物门等[36]。动物类药材由于结构复杂，有着大量蛋白质分子，对于特殊的组织样本还需要紫外杀菌处理。传统的鉴定方法虽然简单快速但缺乏准确性，DNA条形码技术能够准确鉴别动物类药材种类及其混伪品[37]。常用分析方法包括种内种间遗传距离计算、序列对比、构建系统发育树等[38]。
　　5 DNA 条形码中药鉴定应用中存在的问题
　　DNA条形码技术在鉴定中药材方面，因其DNA序列独一无二的特性，有着传统鉴定方法无可比拟的优势，但也存在着一些局限性。对于一些特定的动植物药材，DNA无法区分具体的用药部位[25]。DNA条形码技术很大程度取决于提取DNA的质量，目前尚未有很好的办法完全保证提取DNA的质量满足鉴定的要求，许多中药材在保存运输过程中容易发生褐变、霉变。采用新鲜植物叶片作为鉴定材料能否攻克 DNA 降解和断裂问题，还需要進一步实践和验证[39]。对于储存时间过长的中药材样品中保留的片段较小，特别是对饮片或加工后的药材鉴定非常困难[40]。因此，在样品采集和贮藏过程中要尽可能做到规范，防止DNA出现严重降解，在分子鉴定中要尽量使用植物新鲜叶片去提取DNA，确保在DNA条形码鉴定过程中用于扩增DNA 模板量充足。另外，加强在基因水平上的研究，获取更丰富的碱基序列，不断优化条形码质量，从而可以选择片段更小的基因作为 DNA 条形码[41]。通用性越好的条形码鉴定物种的类别越多，但尚未存在适用于所有动植物的通用条形码。另外，DNA条形码对于天然矿物类的药材无法进行鉴别，因此DNA条形码技术仍需要与传统鉴定方法结合，才能在中药材鉴定中做到全面、准确[42]。另外DNA条形码技术只能做到药材真伪鉴别，而对于解决药材质量的评定还存在很大困难[43]。
　　6 展望
　　如今DNA条形码已经大量应用在各个领域，不仅仅是在鉴定中药材方面，对于植物进化、系统分类、保护物种多样性也有着重要意义[44]。DNA条形码作为一种新型的分子鉴定技术，因其快速、简便、鉴别度高等优点在中药鉴定领域处于高速发展的趋势。中药在性状发生改变加工成饮片的状态下也不影响鉴别，扩大了鉴定样本的容量。引物序列的通用性，可实现DNA条形码的流程化和规范化，仅仅通过相关的实验人员即可完成批量鉴定。然而新的技术也必然存在着不完善的地方，单一靠DNA条形码技术无法完全实现对中药来源的控制[45]。许多通用引物在扩增过程中易发生碱基缺失突变，并且在 PCR 扩增过程中也存在扩增失败的情况[46]。在常用鉴定植物的5对条形码中，ITS2序列对大多数植物可以进行鉴定，但也仍存在不少植物鉴定效果不理想或不能鉴定的情况[47]。因此，要逐步完善DNA 条形码鉴定体系需要多种序列进行补充。在鉴定中药材的过程中，应充分整合动植物类药材的遗传信息DNA，及其药材性状、组织或细胞的显微特征等，然后按照相应的分析方法对中成药原料药材或未知药材进行多角度、多层次的鉴别，更加精确化、客观化地鉴定中药材[48]。
　　中药材的质量不仅关系到整个中医中药行业的可持续健康发展，更是向海内外弘扬我国中医文化的重要基础和必要条件。随着分子生物学技术的不断发展，科技手段的日新月异，人们能够从微观的角度来鉴定中药材的质量，建立更加优越的中药材质量检控体系。DNA条形码技术载入《中国药典》至今，因其独特的鉴定优势已成为鉴定中药材的重要手段之一。在大力推进DNA条形码技术发展的同时，也应不断创新发展更多的鉴定方法，来保证中药材使用的安全性和有效性，使我国的中医药事业持续稳步上升。
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