红茂草异紫堇碱对LPS诱导小鼠RAW 264.7细胞炎症因子的影响

来源:用户上传      作者:王霞 王廷璞 袁毅君 高义霞 王鹏 赵强 赵仁生

　　摘要[目的]研究红茂草异紫堇碱对细菌脂多糖（ lipopolysaccharide，LPS）诱导RAW 264.7细胞释放炎性因子的影响。[方法]用CCK-8试剂盒方法检测不同剂量红茂草异紫堇碱（1、5、15、25、50、100、200、300和400 μg/mL）对RAW 264.7细胞的毒性作用;用硝酸酶还原法测定不同浓度红茂草异紫堇碱（50、100、200和400 μg/mL）条件下细胞培养液中NO的浓度;用ELISA法测定添加不同浓度红茂草异紫堇碱（100、200和400 μg/mL）干预4 h，再加入LPS（0.1 μg/mL）孵育20 h后细胞培养液中IL-1β、IL-6、IL-10、PEG-2和TNF-α的含量，通过上述方法测定的结果来评价红茂草异紫堇堿的抗炎作用。[结果]红茂草异紫堇碱浓度在15、25 μg/mL时，可显著促进RAW 264.7细胞增殖（P≤0.05）;并且在红茂草异紫堇碱存在条件下，促炎因子IL-1β、IL-6、PEG-2和TNF-α释放量都有不程度的降低，而抗炎因子IL-10和NO的释放量有不同程度的升高。[结论]红茂草异紫堇碱能够抑制促炎因子IL-1β、IL-6、PEG-2和TNF-α的释放;另一方面能够促进抗炎因子IL-10和NO的释放来抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应。
　　关键词红茂草异紫堇碱;RAW 264.7细胞;LPS;细胞炎症因子
　　中图分类号R285.5文献标识码A文章编号0517-6611（2020）04-0178-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.051
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Effects of Isocorydine Alkaloid in Dicranostigma leptopodum （Maxim.） Fedde（DLF）on Inflammatory Factors in RAW264. 7 Cells Stimulated by LPS
　　WANG Xia，WANG Ting-pu，YUAN Yi-jun et al
　　（College of Bioengineering and Technology， Tianshui Normal University， Tianshui，Gansu 741001）
　　Abstract[Objective] To study the effects of isocorydine alkaloid in Dicranostigma leptopodum （Maxim.） Fedde （DLF） on secretion of inflammatory factors in RAW 264.7 cell stimulated by lipopolysaccharide，LPS. [Method]Toxic effect on RAW 264.7 cell with different doses of isocorydine alkaloid in DLF （ 1， 5， 15， 25， 50， 100， 200， 300 and 400 μg/mL） were detected by CCK 8 kit method. The concentration of NO in cell medium added different doses of isocorydine alkaloid in DLF （50， 100， 200 and 400 μg/mL） were detected by the enzyme nitrate reduction method. After pretreated with various concentration of isocorydine alkaloid in DLF（100， 200 and 400 μg/mL） 4 h. The cell were exposed to 0.1 μg/mL LPS for 20 h. The activity of interleukin 6（IL-6）、10（IL-10） and 1β（IL-1β）， PEG-2 and tumor necrosis factor α（TNF-α） as well as NO by ELISA and an Nitrate acid reductase. The anti-inflammatory effect was evaluated by above method. [Result] Concentration of isocorydine alkaloid in DLF were 15 and 25 μg/mL， which could promote RAW 264.7 cells proliferation significantly （P≤0.05）. Isocorydine alkaloid in DLF increased the secretion of IL-10 and NO as well as reduced IL-1β，IL-6，PEG-2 and TNF-α in LPS-induced RAW 264.7 cells. [Conclusion] The anti-inflammatory effectory of isocorydine alkaloid in LDF may be mediated in part of by promoting IL-10 and NO and inhibiting the production of IL-1β，IL-6，PEG-2 and TNF-α.
　　Key wordsIsocorydine alkaloid in DLF;RAW 264.7 cells;LPS;Inflammatory factors 　　红茂草[Dicranostigma leptopodum（Maxim.）Fedde，DLF] 罂粟科秃疮花属二年生或多年生草本植物，俗称秃子花、秃疮花、勒马回（陕西），主要分布在云南西北部、四川西部、西藏、青海东部、甘肃南部及东南部、陕西秦岭北坡、山西南部、河南西部、河北西南部，生于海拔400～2 900 m草坡、路边、田埂、墙头或屋顶[1]。《陕西中草药》记载：“味苦、涩、性凉、清热解毒，消肿，止痛，杀虫。治扁桃体炎，牙痛，咽喉痛，淋巴结核，秃疮，疮疖疥癣，痈疽”[2]。红茂草生物碱主要包括异紫堇碱、紫堇碱、原阿片碱和百屈菜碱，其中异紫堇碱的含量最高[3]。试验研究证明，红茂草素注射液对小鼠脾脏、红细胞的吞噬功能会产生影响;低剂量红茂草素注射液（0.2 g/kg）具有促进红细胞免疫黏附的作用，还能明显促进脾细胞分泌IL-2，且无剂量依赖关系;而5.0、1.0 g/kg 能使血清溶血素含量升高[4-6]。王廷璞等[7-10]研究发现红茂草在一定浓度范围内对细胞具有毒性作用，并对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌有明显的抑制作用 。毛爱红等[11]研究发现红茂草生物碱对四氯化碳引起小鼠肝脏记性损伤具有很好的保护作用。龚艳妮等[12]研究表明红茂草注射液可显著促进荷瘤小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞的增殖 。赵强等[13]研究发现红茂草生物碱具有良好的安全性。红茂草的异紫堇啡碱、原阿片碱药理作用已有较广泛的研究，而异紫堇碱的研究较少，主要集中在抗失血性休克、解痉、抗缺氧作用。
　　细菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要组分之一，其毒性成分主要为类脂质A，感染后会产生毒性反应。在人体免疫系统对抗细菌入侵时，LPS作为重要的抗原分子被抗原递呈细胞（APC）捕获，从而引起机体的免疫反应。体内免疫细胞如巨噬细胞在LPS诱导下会大量释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等炎症因子，但是适量的炎症因子可有利于免疫系统发挥正作用，如果过量就会对机体造成病理损伤，另一方面可能造成促发全身炎症反应，进一步引发多器官功能衰竭，甚至死亡的后果[14-17]。因此，LPS诱导的RAW 264.7细胞是研究炎症机制的很好的炎症细胞模型[18]。
　　目前关于红茂草异紫堇碱体外抗炎作用机制的相关研究鲜见报道。因此天水师范学院生物工程与技术学院甘肃省高校农业微生物重点实验室和免疫学实验室提取分离纯化出红茂草异紫堇碱，拟采用 LPS 诱使小鼠 RAW 264.7 巨噬细胞活化，建立体外炎症模型，通过检测红茂草异紫堇碱对细胞上清中NO 的分泌量及炎性细胞因子IL-1β、IL-6、PEG-2、TNF-α和IL-10 的分泌水平，旨在研究红茂草异紫堇碱抗炎作用机制，从而判断红茂草异紫堇碱在机体外的抗炎效果，为深入研究红茂草异紫堇碱体外抗炎作用机制打下基础，也为其临床应用提供一定的理论参考。
　　1材料与方法
　　1.1材料
　　1.1.1细胞。RAW 264.7细胞来源于ATCC，由北纳联创生物技术研究院代购。
　　1.1.2仪器及主要试剂。CK Model 680型酶标仪，日本Bio-Rad公司;红茂草异紫堇碱由天水师范学院生物工程与技术学院王廷璞研究员提供;LPS为sigma公司产品;IL-1β、IL-6、IL-10、PEG-2和TNF-α试剂盒购自欣博盛生物科技有限责任公司;NO试剂盒购自碧云天;胎牛血清购自gibico;DME/F12培养基购自Hyclon;cck-8 購自碧云天。
　　1.2方法
　　1.2.1红茂草异紫堇碱对RAW 264.7细胞的毒性作用。
　　RAW 264.7细胞按4 000个/孔接入96孔板中，0.2 mL/孔，培养过夜。弃去培养基，每孔加入190 μL DME/F12培养基（含10% FBS），空白组加入10 μL PBS，其余各组分别加入红茂草异紫堇碱，使其终浓度分别为1、5、15、25、50、100、200、300和400 μg/mL（分别记为1、5、15、25、50、100、200、300和400 μg/mL组），于二氧化碳培养箱中培养24 h，然后每孔加入10 μL的CCK-8试剂，在二氧化碳培养箱中培养2 h后在OD=450 nm处测定吸光度。各组做3个平行。
　　1.2.2不同浓度红茂草异紫堇碱对LPS诱导RAW 264.7细胞释放NO的影响。
　　RAW 264.7细胞按4 000个/孔接入96孔板中，0.2 mL/孔，培养过夜。弃去培养基，每孔加入180 μL DME/F12培养基（含10% FBS），空白组和阴性对照组每孔加入10 μL PBS，其余各组分别加入红茂草异紫堇碱，使其终浓度分别为50、100、200和400 μg/mL（分别记为50、100、200和400 μg/mL组），于二氧化碳培养箱中培养4 h后空白组加入10 μL 的PBS，其余各孔加入10 μL的LPS（终浓度为0.05 μg/mL），与二氧化碳培养箱中培养20 h。取细胞培养液上清，按NO试剂盒说明书测定NO 的浓度。各组做4个平行。
　　1.2.3不同浓度红茂草异紫堇碱对LPS诱导RAW 264.7细胞释放细胞因子和PEG-2的影响。
　　RAW 264.7细胞按6×104个/孔接入96孔板中，0.5 mL/孔，培养过夜。弃去培养基，每孔加入450 μL DME/F12培养基（含10% FBS），空白组和阴性对照组每孔加入25 μL PBS，其余各组分别加入红茂草异紫堇碱，使其终浓度分别为100、200和400 μg/mL（分别记为100、200和400 μg/mL组），于二氧化碳培养箱中培养4 h后空白组加入25 μL的PBS，其余各孔加入25 μL的LPS（终浓度为0.1 μg/mL），于二氧化碳培养箱中培养20 h。取细胞培养上清液，按IL-1β、IL-6、IL-10、PEG-2和TNF-α试剂盒说明书测定IL-1β、IL-6、IL-10、PEG-2和TNF-α的浓度。各组做5个平行。 　　1.3试验数据处理
　　所有数据用SPSS 22.0软件处理，数据以平均值±标准差表示;组间差异采用独立样本t检验。
　　2结果与分析
　　2.1红茂草异紫堇碱对RAW 264.7细胞活力的影响
　　CCK-8试剂盒是一种基于WST-8化合物而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的测定。细胞增殖越多越快，则试剂盒反应颜色越深;细胞毒性越大，细胞被抑制增殖，则颜色越浅。由表1可知，红茂草异紫堇碱浓度在1和5 μg/mL时，红茂草异紫堇碱促进RAW 264.7 细胞增殖效果十分显著（P≤0.01）;其浓度在15、25 μg/mL时，红茂草异紫堇碱可显著促进RAW 264.7细胞增殖（P≤0.05）;红茂草异紫堇碱在50、100、200、300和400 μg/mL与空白组相比也可促进RAW 264.7细胞增殖（P>0.05）。以上结果表明，红茂草异紫堇碱能促进RAW 264.7细胞增殖，在较低浓度时促进RAW 264.7细胞增殖效果比较明显，在高浓度时也可促进RAW 264.7细胞增殖，但没有低浓度时效果显著。
　　2.2不同浓度红茂草异紫堇碱对LPS诱导RAW 264.7细胞NO释放的影响
　　用不同浓度的红茂草异紫堇碱干预4 h后加入LPS（0.05 μg/mL）共同孵育20 h，用一氧化氮试剂盒检测细胞培养液中NO的浓度。由表2可知，红茂草异紫堇碱可显著促进抗炎因子NO的释放（P≤0.05），并且随着红茂草异紫堇碱浓度的增加，细胞培养液中NO的浓度也随之
　　增高。在细胞内NO可作为信号分子，参与细胞内炎症信号
　　转导的过程，以上试验结果表明，红茂草异紫堇碱可能是通过促进NO分子的释放来抑制细胞发生炎症反应。
　　2.3不同浓度红茂草异紫堇碱对LPS诱导RAW 264.7细胞释放细胞因子和PEG-2的影响
　　在细胞培养液中加入红茂草异紫堇碱干预4 h，加入LPS（0.1 μg/mL）孵育20 h后检测细胞培养液中细胞因子和PEG-2的浓度。
　　由表3可知，空白组中TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度较低，与阴性对照组相比LPS的加入可十分显著地促进TNF-α、IL-1β和IL-6的释放（P≤0.01）。在200和400 μg/mL的红茂草异紫堇碱的浓度条件下，可显著抑制RAW 264.7细胞对TNF-α的释放（P≤0.05），与阴性组相比，100 μg/mL的红茂草异紫堇碱也可抑制TNF-α的释放，但不具有统计学意义（P>0.05）;在100、200和400 μg/mL的红茂草异紫堇碱浓度条件下，不能显著降低细胞培养液中IL-1β的浓度（P>0.05），但从变化趋势分析，当红茂草异紫堇碱的浓度为400 μg/mL，可以抑制RAW 264.7细胞释放IL-1β;在200和400 μg/mL的浓度条件下的红茂草异紫堇碱可显著抑制RAW 264.7细胞释放IL-6（P≤0.05，P≤0.01）;与阴性组相比，100 μg/mL浓度条件下的红茂草异紫堇碱也可抑制IL-6的释放，但不具有统计学意义（P>0.05）。
　　红茂草异紫堇碱浓度在100、200和400 μg/mL 的条件下可显著促进RAW 264.7细胞释放抗炎因子IL-10（P≤0.05），随着其浓度的增大抗炎因子的释放量也随之增大;在200和400 μg/mL浓度条件下的红茂草异紫堇碱可显著抑制RAW 264.7细胞释放炎症因子PEG-2（P≤0.05），其浓度为100 μg/mL时，与阴性对照组相比，红茂草异紫堇碱也可抑制RAW 264.7细胞释放PEG-2，但不具有统计学意义（P>0.05）。由此可见，红茂草异紫堇碱可以抑制促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的释放，且随着红茂草异紫堇碱浓度的增加，抑制作用也表现增强效应。红茂草异紫堇碱通过促进抗炎因子IL-10和抑制炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6和PEG-2的释放来发挥其抗炎作用。
　　综上试验结果推测，红茂草异紫堇碱干扰LPS诱导RAW 264.7细胞分泌IL-1β、IL-6、PEG-2、TNF-α的释放，另一方面促进IL-10的释放和NO的分泌发挥抗炎作用。
　　3讨论与结论
　　炎症反应是临床常见的病理过程，近来有文献报道核因子-κB（NF-κB）和有丝分裂原激活磷酸激酶（MAPKs）的激活可以调节炎性因子[19-21]，并且炎症过程中细胞会产生一系列因子可能会影响线粒体功能[22-23]。除此之外，脂多糖（LPS）为革兰氏阴性菌细胞壁的主要组成成分也能够诱导机体全身性炎症反应，在体外常用于刺激免疫细胞来筛选抗炎药物[24]。
　　LPS刺激RAW 264.7细胞后，可诱导其产生诱导性一氧化氮合成酶，进而合成大量的NO气体分子。在免疫性炎症发病进程中，体内NO 水平升高可从多个途径影响病理进程[25-26]，NO是具有生物气体分子，浓度的变化可调节细胞内信息的传递，在免疫应答中发挥很重要的作用[27-28]。该研究发现红茂草异紫堇碱浓度在1～400μg/mL时，对RAW 264.7 细胞无毒害作用。红茂草异紫堇碱可通过促进NO的释放从而起到抗炎作用，随着红茂草异紫堇碱浓度的增大，在细胞培养液中NO的浓度也随之增大。
　　LPS能够诱导RAW 264.7细胞分泌炎性因子，如NO、IL-1β、IL-6、PEG-2和TNF-α等[29]。在正常水平下它們参与机体的免疫调节、发挥抗感染的作用。但是随着这些炎症因子在体内的浓度增大，它们可刺激免疫细胞和非免疫免疫细胞释放多种细胞因子（如IL-18、E-选择素和ICAM-1等），从而扩大炎症反应。IL-10是一种抗炎因子，主要通过活化巨噬细胞来发挥其抗炎作用;IL-6在获得性免疫和先天性免疫中发挥重要的作用，它通过调节T细胞的活性在慢性炎症中发挥重要的作用;IL-1β作为一种促炎因子，主要在炎症反应初期发挥作用，IL-1β通过旁分泌和自分泌的方式诱导其他促炎因子的产生，并诱导中性粒细胞向炎症部位聚集，从而加重组织的炎症反应;TNF-α是由单核-巨噬细胞分泌的一种细胞因子，在炎症反应中起主要的作用;PEG-2在体内是一种重要的促炎因子，IL-1β刺激细胞产生并向炎症部位聚集，进一步对组织造成损伤[29]。 　　该研究中发现，红茂草异紫堇碱一方面通过促进IL-10的釋放和NO的分泌来缓解LPS诱导的RAW 264.7细胞的炎症反应，另一方面通过降低IL-1β、IL-6、PEG-2和TNF-α的释放量来起到抗炎的作用。该研究为以后开发非特异性抗炎药物及抗炎药物的筛选提供重要依据，也为其临床应用提供一定的理论参考。
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