七叶皂苷钠对小鼠变应性接触性皮炎作用研究

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　　【摘 要】 目的：研究七叶皂苷钠对小鼠变应性接触性皮炎（ACD）的治疗作用。方法：60只SPF级昆明小鼠随机分为6组：正常对照组、模型对照组、阳性对照组、七叶皂苷钠（SA）低、中、高剂量组（1.8、3.6、7.2mg/kg），每组10只。用2，4-二硝基氯苯（DNCB）致敏和激发建立小鼠ACD模型，以小鼠耳部耳廓肿胀度、脾指数和组织病理学检查为评价指标。结果：七叶皂苷钠能够减轻小鼠腹部皮损炎症情况，抑制小鼠耳廓肿胀增加，降低小鼠脾指数。随着SA浓度的增加，真皮层细胞水肿变性得到缓解，组织炎症细胞浸润减少。结论：七叶皂苷钠对小鼠变应性接触性皮炎具有一定的治疗作用，其作用机制有待进一步研究。
　　【关键词】 七叶皂苷钠;变应性接触性皮炎;七叶树
　　【中图分类号】R285.5   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2020）1-0008-05
　　Abstract：Objective To study the therapeutic effect of sodium aescinate on allergic contact dermatitis （ACD） in mice.Methods Sixty SPF Kunming mice were randomly divided into six groups： normal control group， model control group， positive control group， low， medium and high dose group of sodium aescinate （SA） （1.8， 3.6 and 7.2mg/kg）， with 10 mice in each group. ACD model of mice was established by sensitization and stimulation with 2，4-dinitrochlorobenzene （DNCB）. Auricular swelling， spleen index and histopathological examination were used as evaluation indexes. Results Sodium aescinate can alleviate the inflammation of abdominal skin lesions， inhibit the increase of auricle swelling and reduce the spleen index of mice. With the increase of SA concentration， the edema and degeneration of dermal cells were alleviated， and the infiltration of inflammatory cells was reduced. Conclusions Sodium aescinate has a certain therapeutic effect on allergic contact dermatitis in mice， and its mechanism needs further study.
　　Keywords：Sodium Aescinate;Allergic Contact Dermatitis;Aesculus Chinensis
　　 七葉树又名婆罗树、梭罗树，属落叶乔木，与悬铃木、榆树、椴树并称为世界四大优美行道树。在我国种类较多，分布范围广。其中中华七叶树（Aesculus chinensis Bge）、浙江七叶树（A.chinensis Bge.var.ChekiangensisFang）和天师栗（A.wilsonii Rehd）的干燥成熟种子称“娑罗子”，是中国药典收载的常用中药。娑罗子的主要成分为皂苷类化合物，具有疏肝、理气、和胃、止痛、杀虫之功效[1]，还具有抗炎、消肿胀、抗渗、抗癌作用[2]，来临床用于治疗冠心病。七叶皂苷钠主要成分为七叶皂苷钠A、B、C、D，是从七叶树科植物天师栗的干燥种子娑罗子中提取得到的一种含酯键的三萜皂苷，其具有抗炎、抗渗出，提高静脉张力，加快静脉血流，促进淋巴回流，改善血液循环和微循环的作用[3]。临床上用于脑水肿、创伤或手术所致肿胀，也用于静脉回流障碍性疾病[4-5]。目前，已开发出七叶皂苷钠冻干粉针剂、七叶皂苷钠搽剂、复方七叶皂苷钠凝胶、七叶皂苷钠片等剂型[6]。
　　 变应性接触性皮炎（Allergic contact dermatitis，ACD） 是T细胞介导的针对皮肤接触致敏原的免疫反应[7]，是最常见的皮肤病之一，具有难预防、发病机制复杂多样的特点。减少炎性细胞聚集、促进皮肤屏障功能恢复是目前治疗ACD的一个突破口。小鼠耳廓ACD 模型是最常用的小鼠ACD 模型，已有数十年历史[8]。该模型用耳廓作为皮炎的靶部位，根据炎症耳廓的厚度及单位面积炎细胞数来判断抗皮炎药物的疗效。DNCB丙酮液是一种常见的致敏剂，可致敏和激发动物皮肤出现典型的接触性皮炎损害，在制作变应性接触性皮炎动物模型中被广泛应用[9-10]。该模型具有在二次抗原激发时不需要剔除毛发，炎细胞浸润数量多等优点。研究表明七叶皂苷钠对抗炎具有一定作用，但是其对ACD是否有抑制作用少有报道，本研究通过建立2，4-二硝基氯苯（ DNCB） 诱发的小鼠ACD模型，研究七叶皂苷钠对小鼠ACD的治疗作用。
　　1 材料和方法
　　1.1 实验动物 SPF级昆明小鼠，体重18～22g，60只，雌雄各半，由湖北省实验动物研究中心提供，实验动物使用生产许可证号：SYXK（鄂）2016 -0089，实验动物质量合格证号：NO.42816300002333，实验动物设施使用证明编号：NO.00263059。每笼5只，只有进食和饮水，饲养于本单位SPF级小鼠实验室。实验室温度20～25℃，湿度40%～70%。 　　 1.2 试剂和仪器 2，4-二硝基氯苯（DNCB）、丙酮（国药集团化学试剂有限公司，分析纯），复方醋酸地塞米松乳膏（批号：1802010S，华润三九医药股份有限公司），七叶皂苷钠（批号：170410A，武汉爱民制药有限公司），电子天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司），倒置生物显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）。
　　1.3 实验方法
　　 1.3.1 小鼠ACD模型的建立 按
　　参考文献建立模型[11-15]，小鼠腹部脱毛（3cm× 3cm）后，用5% DNCB 丙酮橄榄油（丙酮/橄榄油=4∶ 1）溶液100μL致敏，第2天再次涂100μL强化致敏。第5天小鼠右耳内外侧耳面涂以1%DNCB丙酮橄榄油溶液20μL进行激发。
　　 1.3.2 分组和给药 实验动物随机分为6组，分别为：正常对照组、模型组、阳性对照组和七叶皂苷钠组（分为低、中、高给药组，其浓度分别为1.8、3.6和7.2mg/kg），每组10只，雌雄各半。正常对照组给予等量生理盐水，按人与小鼠剂量换算公式，小鼠复方醋酸地塞米松乳膏用量为10mg/kg。所有药物均于致敏前1d 将受试物均匀涂于各小鼠右耳的正反两面，每日1次，连续给药7d。除空白对照组，其它各组于给药第2、3天进行致敏和强化致敏，给药第6天各组进行激发。
　　 1.3.3 小鼠ACD模型评价指标 激发前、激发后48h分别对小鼠耳部红斑、水肿、抓痕进行评分作为耳部皮损情况评价指标，评分标准见表1;耳部皮损情况评分为建模成功与否及过敏反应程度的评价指标。
　　1.3.4 小鼠耳廓肿胀度和脾指数测定 激发后48h安乐死处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用7mm 打孔器分别在两耳同一部位打下耳片，称重，以两耳片的重量差异为肿胀度。耳廓肿胀抑制率计算如下：抑制率（%） = （模型对照组肿胀度-实验组肿胀度） /模型对照组肿胀度 × 100%。同时取小鼠脾脏称重，以每10g体重的脾质量作为脾指数。
　　1.3.5 小鼠耳廓组织病理学检查 激发后48h，每组分别取5只小鼠，取右耳皮肤组织标本经石蜡包埋固定，制成5μm薄层切片，以苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）进行染色，并使用光学显微镜观察皮肤组织的病理变化，主要包括真皮水肿程度、炎症细胞浸润及其数目变化等情况。
　　1.3.6 统计学方法 采用 SPSS 19. 0统计软件对实验数据进行分析，实验数据用均数加减标准差（x±s）表示。计量资料满足正态分布时，多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）法，满足方差齐性时两两比较用LSD法，方差不齐时采用Dunnetts T3 法依次检验第i组实验组和对照组间的差别;实验数据不满足正态分布时，多组比较采用 Kruskal-Wallis H 检验，计数资料用秩和检验分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
　　2 结果
　　 2.1 小鼠ACD模型评价指标 小鼠经耳部给予1% DNCB，激发30min后，可见耳部激发处皮肤开始红肿，小鼠搔抓现象明显;48h后模型组小鼠耳部红肿明显，阳性对照组和不同剂量给药组耳部红肿出现不同程度的缓解，阳性对照组基本恢复正常，不同剂量给药组耳部红肿呈现剂量依赖性趋势，表明小鼠 ACD 模型成功建立。小鼠耳部皮肤状况，评价指标结果见表2。
　　2.2 各组药物对ACD模型小鼠耳肿胀度的影响 七叶皂苷钠给药组和阳性对照组均能对DNCB所致的小鼠耳廓肿胀有明显抑制作用，其中高、中剂量组均可明显抑制DNCB诱发的小鼠耳廓肿胀，与模型组比较差异有显著统计学意义（P<0.01），并且高剂量组的肿胀抑制率（76.05%）与模型组（79.10%）接近，各剂量组的效果呈现剂量依赖关系趋势。见表3。
　　2.4 小鼠ACD模型耳廓皮肤组织病理变化 空白对照组耳组织整体结构轻度异常，表皮细胞排列整齐（粗实线箭头），真皮层细胞无明显水肿变性，组织无明显炎症细胞浸润。模型组耳组织整体结构异常，可见部分表皮细胞坏死变性（粗实线箭头）;真皮层胶原纤维排列紊乱，真皮层细胞可见广泛水肿部分胞浆空泡化（细实线箭头）;且组织可见大量炎症细胞浸润（细虚线箭头）。七叶皂苷钠低剂量组耳组织整体结构基本正常，真皮层细胞可见轻微水肿（细实线箭头），组织无明显炎症细胞浸润。中剂量组耳组织整体结构基本正常，真皮层细胞减少，无明显水肿变性，组织可见少量炎症细胞浸润（细实线箭头）。高剂量组的耳组织整体结构基本正常，真皮层细胞无明显水肿变性，组织无明显炎症细胞浸润。七叶皂苷钠3个剂量组表皮细胞间和细胞内轻度水肿，以及炎症细胞浸润都有一定程度的减少。表明七叶皂苷钠对DNCB诱导的ACD模型有明显的抑制作用。结果如图1所示。
　　2.3 各组药物对ACD模型小鼠脾指数影响 阳性对照组小鼠的脾指数低于正常对照组，而七叶皂苷钠各剂量组小鼠脾指数均高于空白对照组，显著低于模型组（P<0.05）。复方醋酸地塞米松乳膏为糖皮质激素类药物，有免疫抑制作用，用药后小鼠脾指数降低。七叶皂苷钠各组可能通过增强机体的细胞免疫、促进免疫器官发育、恢复异常体液免疫功能，使免疫系统趋于平衡来发挥作用，使得小鼠脾指数降低。结果见表4。
　　
　　3 讨论
　　ACD是最常见的皮肤病之一，具有难预防、发病机制复杂多样的特点，治疗的常用药中，抗组胺药对炎症介质组胺有拮抗作用，对I型超敏反应有效，但不能抑制IV型超敏反應病变部位的炎细胞浸润;糖皮质激素类虽然显效快、作用强、疗效确切，但长期应用可诱发肾上腺皮质功能亢进或减退，存在反跳现象和停药综合症，因而不适合长期临床应用[11]。小鼠耳廓ACD 模型用耳廓作为皮炎的靶部位，根据炎症耳廓的厚度及单位面积炎细胞数来判断抗皮炎药物的疗效。孙明立等[16]建立豚鼠和小鼠ACD模型，验证了DNCB诱导ACD模型的可行性，且小鼠相较于豚鼠具有模型制作时间更短，对致敏物敏感性较强的优点。研究对七叶皂苷钠治疗ACD药效进行了初步研究，结果表明七叶皂苷钠在治疗ACD方面疗效明显，且无糖皮质激素类药物类副作用，提示七叶皂苷钠在治疗ACD中具有一定的优势，其相关作用机制还有待进一步研究。 　　参考文献
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　　（收稿日期：2019-10-23 编辑：程鹏飞）
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