黄芪甲苷免疫亲和色谱介质的制备及应用

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　　摘要：旨在提出1种新的具有高灵敏度、特异性抗黄芪甲苷（AST）单克隆抗体的纯化方法，从而为制备具有类似活性基团的其他天然化合物的亲和层析树脂方法提供参考。用AST与环氧活化琼脂糖6B（EAS6B）偶联制备的免疫亲和柱从小鼠腹水中纯化抗AST的高敏单克隆抗体（mAbs），与用G-葡聚糖凝胶从小鼠腹水中纯化的抗AST单克隆抗体进行比较，通过间接ELISA（酶联免疫吸附测定）和间接竞争ELISA比较2种方法纯化的单克隆抗体，评价亲和培养基的效用。间接ELISA结果显示，用AST-EAS6B柱纯化的抗AST单克隆抗体的效价略高于用G-葡聚糖凝胶柱纯化的抗体效价;间接竞争ELISA结果显示，用AST-EAS6B柱纯化的抗AST单克隆抗体的结合抑制50%浓度（IC50）为 0.005 μg/mL，用G-葡聚糖凝胶柱纯化的抗AST单克隆抗体的IC50为0.05 μg/mL，用AST-EAS6B柱纯化的抗AST单克隆抗体比用G-葡聚糖凝胶柱纯化的抗AST单克隆抗体对AST更具有特异性。
　　 关键词：亲和色谱层析介质;黄芪甲苷;环氧活化琼脂糖凝胶6B;ELISA;SDS-PAGE
　　 中图分类号： O657.7  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）03-0218-04
　　目前纯化抗体的方法主要包括不同组合的G蛋白纯化、离子交换法和排阻色谱技术等[1]。然而，这些方法有时不能有效分离出某些特异性抗体[2]。因此，使用这些非特异性纯化方法分离的抗体还不能完全满足许多研究应用的要求[3]。免疫亲和色谱（IAC）是一种液相色谱，其中固定相由抗体或抗原试剂组成，该技术代表亲和色谱的一个特殊亚类，其中的生物相关结合剂用于选择性纯化或分析目标化合物[4]。由于抗体与它们各自的靶标能够选择性和特异性结合，这使它们作为亲和色谱中的固定配体多年来倍受关注。IAC使用的主要方法是利用固定化靶标进行抗体纯化[5]。
　　黄芪甲苷（astragaloside Ⅳ，简称AST）是中药黄芪药理活性的主要物质之一，为黄芪及其制剂质量鉴定的指标成分。药理研究结果表明，AST具有调节机体免疫力、保护组织器官、降低血糖、抗细胞凋亡和抗炎抗病毒等多方面的作用，具有非常广阔的发展前景[6]。本研究以黄芪甲苷为配体，采用环氧活化琼脂糖6B（EAS6B）亲和色谱法，从小鼠腹水中纯化抗AST单克隆抗体。用间接酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简称ELISA）和间接竞争ELISA对用AST-EAS6B纯化的抗体与用G-葡聚糖亲和色谱纯化的抗体的效价和特异性进行比较。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　AST标准品，成都曼特生物技术有限公司（成都）;3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）底物缓冲液，北京索莱宝科技有限公司（北京）;辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG+[免疫球蛋白（IgG）二抗]，武汉博斯特生物科技有限公司（武汉）;环氧活化琼脂糖6B，购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，美国）;本研究所用其他化学药品均购自中国药品化学试剂有限公司（北京）。
　　AST-卵清蛋白（AST-OVA）和含有抗AST单克隆抗体的小鼠腹水，由笔者所在实验室制备，前期笔者所在研究团队对黄芪甲苷人工抗原的合成与评价进行了研究[7]。
　　1.2 方法
　　1.2.1 亲和介质的制备（AST-EAS6B） AST在固体载体上的共价偶联是根据制造商对环氧活化的琼脂糖凝胶6B（Sigma-Aldrich）和相关文献的说明进行的。方法如下：将0.2 g EAS6B悬浮在 50 mL 蒸馏水中，在溶胀后（1 g冻干粉末约产生 3.5 mL 最终体积的介质），用200 mL蒸馏水洗涤介质1 h;将10 mg AST溶于5.1 mL甲醇（体积分数为80%，pH值为11.0）中，将含有AST的溶液与介质在塞式容器中混合，并在40 ℃下于水浴中振摇 16 h，过量AST用甲醇（体积分数为80%）洗涤。然后将培养基转移至1 mol/L乙醇胺（pH值为8）中，于50 ℃过夜。最后，用 1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH值为8，含有 0.5 mol/L NaCl）彻底冲洗产品3次。空白介質（指未用AST耦合的环氧活化琼脂糖凝胶6B介质）的具体制备方法如下：将0.2 g EAS6B悬浮在50mL蒸馏水中，溶胀后（1 g冻干粉末产生约3.5 mL最终体积的介质）用200 mL蒸馏水洗涤介质1 h;然后将培养基转移至1 mol/L乙醇胺（pH值为8）中，于50 ℃过夜;最后用1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH值为8，含有0.5 mol/L NaCl）彻底冲洗产品3次。
　　1.2.2 抗AST单克隆抗体的纯化 为了用AST-EAS6B纯化抗AST抗体，本试验制备了免疫亲和色谱柱，从含抗AST单抗的5 mL小鼠腹水中纯化了活性抗AST单抗。将AST-EAS6B介质装入1个普通的固相萃取柱中，上部、下部装上筛板。对固相萃取流出液进行收集，并利用紫外分光光度计（Huxi HD-21-2）进行分析。用偶联缓冲液洗涤柱子，直到流出液在280 nm处的吸光度为0。然后，用10倍柱体积的纯化水冲洗，并用10倍柱体积的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（NaH2PO4/Na2HPO4，pH值为7.0）平衡。用20 mL平衡缓冲液稀释含抗AST单抗的小鼠腹水（5 mL），以0.3 mL/min的流速装入柱中。样品装入后，用10倍柱体积的平衡缓冲液冲洗，然后用洗脱缓冲液（0.1 mol/L甘氨酸缓冲液，pH值为2.7）洗脱mAb（单克隆抗体，指AST单抗），直到流出液在280 nm处的吸光度为0，洗脱的抗体立即用Tris碱中和。用G-葡聚糖凝胶纯化单克隆抗体时，将G-葡聚糖凝胶装入固相萃取柱中，上部、下部装上筛板，后续方法与上述用AST-EAS6B纯化抗AST抗体的方法相同。为了比较，使用“1.2.1”节的空白介质制备的柱纯化5 mL小鼠腹水作为对照。纯化后，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，10%丙烯酰胺）分离，用考马斯亮蓝（CBB）染色，用微量蛋白UV定量仪测定纯化的单克隆抗体浓度[8-9]。 　　1.2.3 间接ELISA和间接竞争ELISA检测抗AST单克隆抗体 用间接ELISA检测时，将AST-OVA用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液（pH值为9.6）溶解成浓度为1.25 μg/mL，包裹在96孔微量滴定板（美国康宁公司）上，于4 ℃孵育过夜;用含0.05%吐溫20的磷酸盐吐温缓冲液冲洗3次，再用1%（m/V）脱脂奶粉在37 ℃磷酸盐缓冲液中封闭1 h，封闭非特异性蛋白结合位点。将纯化的单克隆抗体、阴性对照组（生理盐水）和空白对照组（用相同方法纯化的无单克隆抗体的正常小鼠腹水）在磷酸盐缓冲液中稀释至1 ∶ 1 000～1 ∶ 50 000，每孔加入100 μL，1式3份。将微孔滴板在37 ℃下孵育60 min，用磷酸盐吐温缓冲液洗涤，在每个孔中加入1 ∶ 5 000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG+。将平板在37 ℃下孵育1 h，洗净，加入TMB基质溶液（含0.2 mg/mL TMB，将50 μL 30% H2O2溶解在10 mL 0.1 mol/L柠檬酸盐-0.2 mol/L磷酸盐缓冲液中，pH值为 5.2），将平板在室温下孵育30 min，用50 μL 2 mol/L H2SO4终止反应，使用BioTek ELx800 ELISA阅读器在450 nm波长下测量吸光度[10]，试验1式3份，以平均值作为最终值。用间接竞争ELISA（idcELISA）方法检测纯化的抗AST单克隆抗体的特异性时，以50 μL连续稀释的AST为竞争物，与50 μL最佳稀释的纯化抗AST单克隆抗体一同加入微孔中，1式2份。在阳性对照孔中，抗AST单克隆抗体没有添加任何竞争物AST，其他步骤与间接ELISA所描述的步骤相同。
　　2 结果与分析
　　在抗AST单克隆抗体的纯化步骤中，从加入 5 mL 小鼠腹水开始，将纯化的mAb冷冻干燥、称质量。结果表明，用AST-EAS6B柱纯化的抗AST单克隆抗体为2.9 mg，用G-葡聚糖凝胶柱纯化的抗AST单克隆抗体为3.5 mg。用磷酸缓冲盐溶液将2种方法纯化的mAb稀释到1 mg/mL的浓度，用间接ELISA法检测抗AST抗体的效价，用间接竞争ELISA法测定抗AST抗体的敏感度。如表1、图1所示，用AST-EAS6B柱纯化的抗AST单克隆抗体的效价大于25 600，而用G-葡聚糖凝胶柱纯化的抗AST单克隆抗体的效价约为18 000。由图2可以看出，用AST-EAS6B柱纯化的抗AST单克隆抗体的效价略高于用G-葡聚糖凝胶柱纯化的抗体效价。间接竞争ELISA结果（表2、图2）显示，用 AST-EAS6B 柱纯化的抗AST单克隆抗体的结合抑制50%浓度（IC50）为0.005 μg/mL，用G-葡聚糖凝胶柱纯化的抗AST单克隆抗体的IC50为 0.05 μg/mL。间接ELISA、间接竞争ELISA检测结果表明，阴性对照的D450 nm显著低于抗AST单克隆抗体的D450 nm（P<0.05）。最终值采用3个重复的平均值±标准偏差。以上结果表明，用AST-EAS6B纯化的抗AST单克隆抗体比用G-葡聚糖凝胶柱纯化的抗AST单克隆抗体对AST更具有特异性。
　　3 讨论
　　在笔者之前的研究中，从小鼠腹水中纯化抗AST单克隆抗体是用一些非特异性的方法，如蛋白G的不同组合、离子交换和排阻色谱技术。这些用非特异性方法纯化的单克隆抗体对于现实的研究和应用来说不够灵敏，而且纯化耗时较长。当有足够量的抗原被固定时，能够提供较强的结合力，基于固定抗原的亲和层析技术是非常有效的[11]。在本研究中，1 mL ESA6B约耦合1.35 mg AST，并且高的耦合速率确保了AST-EAS6B柱的强结合能力。当用AST与环氧活化琼脂糖6B（EAS6B）偶联制备的免疫亲和柱制备完成后，用该方法从小鼠腹水中纯化抗AST单克隆抗体能够获得高效价、高特异性的抗体。纯化抗AST单克隆抗体的结果表明，固定化AST亲和色谱可以选择性地捕获与AST特异结合的蛋白质，能够有效地完成变性抗体的排除和活性抗体的特异性捕获。本研究结果为进一步研究高灵敏度、高效价的抗AST单克隆抗体奠定了基础，如ELISA检测AST的定量检测方法的建立。此外，基于其选择性捕获与AST结合的蛋白的能力，固定化AST亲和层析可用于鉴定不同组织中的AST靶点[12]。本研究还提供了1种制备具有类似活性基团的其他天然化合物的亲和层析树脂的方法。
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