HPLC测定黑果枸杞鲜果中花青素含量的方法研究

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　　摘  要：目的：优化并建立黑果枸杞鲜果中HPLC的测定方法。方法：采用乙醇、盐酸、水为提取液，超声提取、水浴水解后用HPLC测定黑果枸杞鲜果中的花青素含量。对乙醇浓度、盐酸浓度、超声时间、水浴温度进行正交实验条件优化，对实验的检出限、线性关系、重复性及回收率进行了考察。结果：确定各因素影响主次顺序为水解温度>盐酸浓度>超声时间>乙醇浓度，最优提取条件为盐酸30%、乙醇50%、超声时间15min、沸水浴。本方法6种花青素的检出限都可达到12mg/kg，在1～50μg/mL范围内，除天竺葵色素R2=0.9989外，其余花青素R2均大于0.999，6次独立平行测定RSD均小于4%，6种花青素回收率在89.0%～91.7%。结论：该方法可以用于黑果枸杞鲜果中花青素含量的测定。
　　关键词：黑果枸杞鲜果;花青素;高效液相色谱;正交实验
　　中图分类号 TS264.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）01-0024-07
　　Determination of Anthocyanin in Fresh Fruit of Lycium ruthenicum Murr.by HPLC
　　Shu Tong et al.
　　（Qinghai Province Institute for Food Control，Xining 810000，China）
　　Abstract：Objective：A high performance liquid chromatographic （HPLC） method was established for the determination of anthocyanin in fresh fruit of Lycium ruthenicum Murr.，and the orthogonal method was use to research the optimum extraction conditions. Methods：Anthocyanin were extracted by ultrasonic （solvent extraction were ethanol，hydrochloric acid and water），extract was hydrolyzed into major anthocyanins in hot water bath，and then HPLC was used to test the content of anthocyanins. Four factors （concentration of ethanol，concentration of hydrochloric acid，ultrasonic time and water bath temperature） were optimized by orthogonal experiment. The limits of detection （LOD），linearity，repeatability and recovery of the method were studied. Result：The order of primary and secondary of extract factor were temperature of water bath，concentration of hydrochloric acid，ultrasonic time and concentration of ethanol，and optimal extraction conditions were 30% hydrochloric acid，50% ethanol，ultrasonic extract 15 min and boiling water bath;and the result showed that LOD could up to 12mg/kg of all 6 kinds of anthocyanins，the linearity of the method is good （R2 of pelargonidin was 0.9989，and the others'were all above 0.999，over the concentration range from 1 μg/mL to 50μg/mL ），the relative standard deviations （RSD） of 6 tests were all less than 4%，and the ranges of recoveries at different levels were 89.0%～91.7%. Conclusion：the method can be used to test anthocyanidins in fresh fruit of Lycium ruthenicum Murr..
　　Key words：Fresh fruit of Lycium ruthenicum Murr.;Anthocyanin;High performance liquid chromatographic （HPLC）;Orthogonal experiment
　　花青素，又名花色素，是一类水溶性的类黄酮化合物，广泛存在于植物的花、果实、茎、叶中[1]。花青素具有多种生理功能，包括抗氧化、抗辐射、抗衰老以及调节血脂功能，能有效防治动脉粥样硬化等慢性疾病[2-4]。本试验对黑果枸杞鲜果中花青素的提取試剂、提取条件、色谱条件等进行了研究，以期建立黑果枸杞鲜果中花青素成分及含量测定的高效液相色谱法，为黑果枸杞鲜果中花青素的检测提供技术支撑，也为黑果枸杞鲜果及下游产品的质量标准检测体系提供科学依据。 　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂 新鲜黑果枸杞（购自青海兴杞生物科技有限公司）。乙腈、甲醇（色谱纯）：德国Merck;乙醇（色谱纯）：美国MREDA公司;盐酸（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂;超纯水（过0.22μm滤膜）。飞燕草色素标准物质（纯度≥97%）、矮牵牛花色素（纯度≥97%）、矢车菊色素标准物质（纯度≥96%）、天竺葵色素标准物质（纯度≥97%）、芍药色素标准物质（纯度≥97%）、锦葵色素标准物质（纯度≥97%）：法国Extras Synthese公司;牵牛花色素标准物质（纯度≥99%）：日本Tokiwa公司。
　　1.2 仪器与设备 Agilent 液相色谱仪（配DAD检测器）：美国Agilent 公司;XS205 DualRange 电子天平（精度0.0001g）：瑞士Mettler Toledo 公司;T25 digital 型高速匀浆机：德国IKA 公司;QL-902涡旋混匀器：海门市其林贝尔仪器有限公司;KQ-500型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司;DK-600B水浴锅：上海森信有限公司;Centrifuge-5810R离心机：德国effendorf公司;Advantage-A10纯水机：美国Milli-Q公司;精密移液枪：法国Gilson公司。
　　1.3 试验步骤
　　1.3.1 标准溶液的制备 精密称取飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛花色素、天竺葵色素、芍药色素、锦葵色素6种标准物质各5.0mg，分别用10%HCl甲醇溶解并定容至5mL，充分摇匀，配制成1000mg/L的标准储备液，-20℃冷冻保存。在使用中将单一标准储备液进行混合后，用10%盐酸甲醇溶液作为溶剂，并逐级稀释成0.5mg/L，1.0mg/L，5.0mgL，10mg/L，25.0mg/L，50.0mg/L。提取液：将乙醇、盐酸、水按一定比例混合即得，具体比例浓度见表1。
　　1.3.2 样品前处理 取约200g样品匀浆，所得样品-20℃冷冻保存。测定时取5g左右样品于50ml比色管中，加入提取液定容至刻度线。混匀1min，后超声提取其中花青素。超声提取后，于水浴中水解1h，取出冷却后，用提取液再次定容。静置，取上清液用0.45um水相滤膜过滤，上机检测[5]。对其中的乙醇体积分数、盐酸体积分数、超声时间、水浴温度采用L9（34）正交试验，进行正交分析优化提取条件[6]。
　　1.3.3 色谱条件 色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm×5μm;流动相A为含1%甲酸水溶液，流动相B为含1%甲酸乙睛溶液;检测波长：530nm;柱温：35℃;进样量：20μL;梯度洗脱条件，见表2
　　2.2 正交试验结果 为确定花青素提取最佳提取条件，进行了4因素3水平设计正交试验，正交试验方案和结果见表3，以总花青素含量为评价指标，对试验结果进行分析，确定最优提取条件。由极差R确定各因素影响主次顺序为水解温度>盐酸体积分数>超声时间>乙醇体积分数;最佳提取条件为盐酸30%、乙醇50%、超声时间15min、沸水浴。其结果与NY/T 2640-2014方法基本一致。
　　2.3 鲜黑果枸杞花青素检测方法的考察 通过2.1和2.2确定了色谱条件和提取条件后，按其条件对实验的检出限、线性关系、重复性和回收率进行考察。检出限：以3倍信噪比对应的浓度为仪器检出限，对应稀释倍数换算得到方法检出限（以5g称样量、50mL定容体积计）。线性关系：对1.3.1方法配制的标准系列，以标准溶液质量浓度（x（μg/mL））为横坐标，峰面积（y（响应A））为纵坐标绘制标准曲线，分别获得标准曲线方程及R2值。重复性：对同一鲜黑果枸杞分别独立进行了6次平行试验，计算其测定结果的RSD。回收率：分别向黑果枸杞空白试样中添加6种花色素的标准溶液，每种花色素有3个不同的添加水平。检出限、线性关系、重复性实验结果见表5，回收率实验结果见表6。
　　3 结论
　　本研究结果表明，超声提取-盐酸加热水解方法提取鲜黑果枸杞中花青素的最优条件为盐酸30%、乙醇50%、超声时间15min、沸水浴。采用该方法，6种花青素的检出限都可达到12mg/kg，在1～50μg/mL范围内，除天竺葵色素R2=0.9989外，其余花青素R2均大于0.999。6次独立平行测定RSD均小于4%，回收率在89.0%～91.7%。因此，该方法适用于鲜黑果枸杞种花青素的测定。
　　参考文献
　　[1]彭祖茂，邓梦雅，严虞虞，等.植物中花青素含量测定及种类分布研究[J].食品研究与开发，2018，17（39）：100-104.
　　[2]徐美玲，赵德卿.蓝莓花青素的提取及理化性质的研究[J].食品研究与开发，2008（09）：187-189.
　　[3]陶大勇，陈家娟，陈瑛，等.黑果枸杞色素对小鼠抗衰老作用的研究[J].中兽医医药杂志，2008（1）：11-13.
　　[4]徐春明，庞高阳，李婷.花青素的生理活性研究进展[J].中国食品添加剂，2013（3）：205-210.
　　[5]赵子丹，葛谦，牛艳，等.HPLC测定黑果枸杞中花青素的成分及含量[J].食品研究与开发，2017，12（38）：123-129.
　　[6]周榮朝，刘银声.数学研究应用于生产实践的尝试-正交试验在生物化学中的应用[J].华北水利水电学院学报，1995，3：23-26.
　　（责编：张宏民）
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