嗜水气单胞菌灭活疫苗对鲫鱼的免疫效果

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　　摘要：随着食品安全等问题日趋严重，寻找良好而安全的防治细菌性疾病的方法迫在眉睫。本研究利用从患病鲫鱼体内分离的嗜水气单胞菌制备灭活疫苗，用（50±5） g的健康鲫鱼作为试验对象，免疫组腹腔注射制备的疫苗，对照组腹腔注射等量的磷酸缓冲液。二次免疫后1、7、14、21、28 d检测血清凝集效价、血清中溶菌酶活性和酸性磷酸酶活性;二次免疫28 d后，对免疫组和对照组同时腹腔注射嗜水气单胞菌进行攻毒，观察鲫鱼生长状况，记录死亡量。结果表明，免疫组血清凝集效价在免疫后逐渐升高，在21 d达到峰值，明显高于对照组;血清中溶菌酶活性和酸性磷酸酶活性都于免疫后14 d达到峰值，明显高于对照组;攻毒结果显示，免疫组死亡率10.0%，对照组死亡率83.7%，相对保护率达到88.5%。说明制备的嗜水气单胞菌灭活疫苗可以诱导鲫鱼产生免疫应答反应，对嗜水气单胞菌的感染具有较好的免疫保护作用。
　　关键词：嗜水氣单胞菌;疫苗;免疫保护;鲫鱼;血清凝集效价;溶菌酶;酸性磷酸酶
　　中图分类号： S942.5文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）04-0168-04
　　收稿日期：2019-01-09
　　基金项目：国家大宗淡水鱼产业体系上海综合试验站海丰农场示范片（编号：CARS-46-30-6）。
　　作者简介：祭仲石（1989—），男，江苏盐城人，硕士，水产工程师，主要从事水产养殖疾病检测与防治工作。E-mail：973691132@qq.com。
　　嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）属于γ-变形菌纲气单胞菌目气单胞菌科气单胞菌属[1-2]。嗜水气单胞菌是水产养殖中多种疾病的病原菌，广泛存在自然水体与养殖水体中，在池塘水质恶化、养殖对象体质下降时往往诱发疾病，给水产养殖带来重大损失[3-5]。嗜水气单胞菌是一种重要的淡水养殖病原菌，可以感染多种水产动物，其中以细菌性败血症最为严重，一般表现为体表和鳍条充血、肛门红肿、腹部肿胀、有腹水等[6-7]。该病在每年的6—9月高发，暴发迅速，一旦暴发往往造成巨大的损失。目前，治疗嗜水气单胞菌引起的疾病主要还是依靠内服抗生素和外用消毒剂来控制，但是，抗生素和消毒剂的长期不合理使用容易产生耐药菌株[8-9]，同时抗生素和消毒剂在鱼体内残留也导致了食品安全问题。因此，寻找安全有效的方法控制细菌性疾病对水产养殖及食品安全方面具有重要意义。
　　运用免疫学方法，制备细菌疫苗，是控制细菌性疾病最有效的途径。疫苗是由病原微生物制成，常用的有灭活疫苗和弱毒疫苗，灭活疫苗安全性好、制备容易，但其表面部分抗原成分被破坏，所以免疫效果不佳;而弱毒疫苗是由弱毒株制备，免疫效果好，但弱毒疫苗是活菌，存在毒力恢复的风险，所以弱毒疫苗须谨慎使用[10]。水产中常用灭活疫苗免疫养殖鱼类，近年来多项研究表明，嗜水气单胞菌灭活疫苗可以使鱼类取得较好的免疫效果[11-14]。本试验以鲫鱼为研究对象，使用甲醛灭活的嗜水气单胞菌作为抗原，对鲫鱼进行免疫，定期测定鲫鱼血清凝集效价和免疫保护率，旨在为鲫鱼细菌性出血病的防控提供参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验鱼
　　从江苏省盐城市大丰区某鲫鱼养殖场采购健康鲫鱼，规格50 g左右，体表正常，无损伤。于实验室暂养1周，水温（20±0.5） ℃，溶氧含量≥5 mg/L，每天投喂配合饲料2次，及时清除粪便、残饵。
　　1.2 疫苗制备
　　试验用嗜水气单胞菌于2018年分离自大丰某发病塘口，编号HFHL-3-24。将菌种接种于脑心浸液（BHI）液体培养基中，30 ℃培养24 h，离心法收集菌体，使用灭菌的磷酸缓冲液（PBS）调节菌液浓度至1亿CFU/mL。在菌液中添加甲醛，使甲醛终浓度为0.2%，30 ℃培养24 h，经过涂板验证彻底灭活后，离心法收集菌体，使用PBS清洗2～3次，最终调节浓度至1亿CFU/mL，即制出嗜水气单胞菌疫苗，置于4 ℃保存备用。
　　1.3 疫苗安全性检测
　　在超净工作台中吸取100 μL制备好的嗜水气单胞菌灭活疫苗，涂布于BHI固体培养基上，设置3个重复，30 ℃培养48 h，观察是否有菌落形成。取30尾鲫鱼腹腔注射疫苗0.2 mL，另取30尾注射0.2 mL PBS作为对照，观察2周。
　　1.4 免疫与血清收集
　　将暂养后的鲫鱼随机分为2组，每组50尾，分别于200 L水族缸中进行试验。免疫组鲫鱼每尾注射制备的灭活疫苗0.2 mL，对照组每尾注射等量的PBS，第1次免疫7 d后进行二次免疫，然后分别在1、7、14、21、28 d随机从免疫组和对照组中取5尾鲫鱼，尾柄静脉取血，将血液放置于室温下2 h，然后放置于4 ℃冰箱6～8 h，4 ℃下4 000 r/min离心10 min，收集上层血清，-20 ℃保存备用。
　　1.5 血清溶菌酶（LZM）和酸性磷酸酶（ACP）活力测定
　　按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作测定免疫组和对照组血清LZM和ACP。
　　计算公式为：
　　LZM活力=测定管（D2-D1）÷标准管（D2-D1）×标准管浓度（200 U/mL）×样本稀释倍数，U/mL。
　　ACP活力=测定管D÷标准管D×标准管酚含量（0.005 mg）×（100 mL÷0.05 mL），U/100 mL。
　　1.6 血清凝集效价
　　参考吴学婧等的方法[10]，使用96孔U型板进行血清凝集效价测定。在U型板1～12孔中加入100 μL PBS，在第1孔中加入100 μL血清，混匀后依次向后进行2倍稀释，最后每孔加入100 μL的灭活疫苗，混匀后放置于37 ℃恒温培养箱2 h，4 ℃过夜，观察凝集效果。凝集效果判定：“++”表示100%凝集，凝集颗粒明显，液体透明;“+”表示50%凝集，液体较混浊;“-”表示未凝集，液体混浊。出现“+”以上的血清最大稀释度为凝集效价。 　　1.7 免疫保护率测定
　　在二次免疫后28 d，从免疫组和对照组中随机取30尾鲫鱼，每尾鱼腹腔注射0.2 mL嗜水气单胞菌（1亿CFU/mL），每天记录死亡量，观察2周并统计各组的死亡率，计算出相对免疫保护率。免疫保护率（RPS）=（1-免疫组死亡率/对照组死亡率）×100%。
　　2 结果与分析
　　2.1 疫苗安全性
　　将制备的疫苗涂布于BHI固体培养基上，作3个平行，28 ℃放置48 h后，3个平板上均未出现明显菌落，说明嗜水气单胞菌已完全灭活。鲫鱼注射疫苗2周内生活良好，未见明显发病症状和死亡，说明制备的疫苗安全性较好，可以用于后续的试验。
　　2.2 LZM活力随时间变化
　　鲫鱼二次免疫后，血清中LZM活力变化如图1所示。可以看出，免疫组血清中LZM活力逐渐上升，在免疫后14 d达到最高值（188.6 U/mL），然后逐渐下降;对照组血清中溶菌酶活力无明显变化，一直处于较低的水平，免疫组LZM活力14 d后开始明显高于对照组。
　　2.3 ACP活力随时间变化
　　鲫鱼二次免疫后，免疫组血清中ACP活力在免疫后逐渐上升，在免疫后14 d达到最高值（26.4 U/mL），然后趋于稳定，有缓慢下降;对照组血清中ACP活力无明显变化，且一直处于较低的水平，免疫组ACP活力免疫后7 d开始明显高于对照组（图2）。
　　2.4 血清凝集效价
　　鲫鱼注射嗜水气单胞菌疫苗后，其血清抗体凝集效价见表1。结果表明，免疫组鲫鱼血清对嗜水气单胞菌具有明显的凝集作用，免疫组鲫鱼在二次免疫后，其血清凝集效价逐渐上升，在21 d达到最大值（1 ∶512）;对照组鲫鱼的血清凝集效价一直处于较低的水平（1 ∶4），免疫组明顯高于对照组。
　　2.5 免疫保护率
　　二次免疫后28 d，使用嗜水气单胞菌对免疫组和对照组鲫鱼进行攻毒感染试验，攻毒后饲养2周。由表2可知，攻毒2周后，免疫组鲫鱼死亡3尾，死亡率10.0%;对照组鲫鱼死亡26尾，死亡率86.7%。由免疫保护率公式计算得，嗜水气单胞菌HFHL-3-24对鲫鱼的免疫保护率为88.5%。
　　3 讨论
　　鱼类具有相对完善的免疫系统，主要免疫器官是胸腺、肾脏和脾脏，鱼类的免疫系统可以对接种的疫苗产生一定的非特异性免疫和特异性免疫反应，从而保护鱼体，阻止病原菌的入侵[15-17]。
　　鱼类血清中具有多种体现免疫力的酶，溶菌酶和酸性磷酸酶活性是体现鱼体免疫力的重要指标，通过检测酶活性可以了解鱼体的免疫能力。周勇等对施氏鲟免疫注射灭活嗜水气单胞菌疫苗后发现，施氏鲟血清中的溶菌酶和酸性磷酸酶活性分别在免疫后7 d和14 d达到峰值，极显著高于对照组[18];孙金辉等研究嗜水气单胞菌灭活疫苗对虹鳟免疫力和抗病力的影响时发现，嗜水气单胞菌灭活疫苗可以提高虹鳟血清溶菌酶活力，虹鳟免疫后14 d 显著高于对照组，在21 d时达到最大值[11];毛会丽等研究发现，嗜水气单胞菌灭活疫苗可以极大地提高溶菌酶和酸性磷酸酶活性[19]。本研究表明，鲫鱼在注射嗜水气单胞菌灭活疫苗7 d后，溶菌酶和酸性磷酸酶活性明显增强，随着时间推移不断增高，在14 d达到最高峰，随后逐渐下降，到28 d时仍然明显高于对照组，说明嗜水气单胞菌灭活疫苗有效促进了血清中溶菌酶和酸性磷酸酶活性，增强了鲫鱼的非特异性免疫效果。
　　血清凝集效价是判断血清中抗体水平的一项指标，周勇等对施氏鲟免疫注射灭活嗜水气单胞菌疫苗后发现，血清抗体效价于免疫后21 d达到1 ∶203 的峰值，显著高于对照组[18]。刘迅猛使用0.3%甲醛灭活疫苗免疫鲫鱼后，血清抗体效价持续增高，在49 d达到最高值，然后开始下降[20]。本研究结果表明，免疫7 d后，即可见血清凝集效价明显高于对照组，在21 d达到最高值，到试验结束未见明显下降，与其他研究结果略有差异，可能是不同嗜水气单胞菌菌株的抗原决定簇不同和灭活条件不同等因素造成的。孙金辉等将嗜水气单胞菌疫苗免疫虹鳟后发现，嗜水气单胞菌灭活疫苗对虹鳟有较高的免疫保护作用，免疫保护率达到71.43%[11];蒋启欢等研究表明，采用腹腔注射的方式，嗜水气单胞菌疫苗对草鱼的免疫保护率达到90%[12]。本研究的攻毒结果显示，嗜水气单胞菌灭活疫苗对鲫鱼有较强的免疫保护作用，相对免疫保护率为88.5%，与相关研究结果相一致。
　　嗜水气单胞菌是常见的水产致病菌，而抗生素和消毒剂的大量使用容易产生耐药菌株，同时抗生素在鱼体内残留也导致了食品安全问题。因此，应用免疫学原理，研究水产养殖用防控细菌性疾病的疫苗，对水产养殖的健康发展具有重要意义。本研究说明本方法制备的嗜水气单胞菌可以诱导鲫鱼产生非特异性和特异性免疫应答反应，对嗜水气单胞菌的感染具有较好的免疫保护作用，后期还需对免疫途径、免疫期和佐剂等进行研究，以期寻找适合当地大面积生产使用的灭活疫苗。
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