健宫散治疗奶牛产后子宫炎对血清白介素含量的影响

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　　摘要：为探讨中药健宫散对产后子宫炎奶牛治疗前后血清中部分白细胞介素含量的影响以及研究健宫散的抗炎作用机制，选取年龄、胎次、产奶量相近的荷斯坦奶牛18头，按照B型超声波检查结果分为正常组、治疗组和患病组，每组各6头，治疗组进行口服健宫散处理。利用酶联免疫吸附法分别检测各组奶牛用药前、用药中和用药后1、4、7、11、15、20 d血清中白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素2（IL-2）和白细胞介素8（IL-8）的含量。结果表明，中药健宫散能显著降低产后子宫炎奶牛血清中IL-1、IL-2和IL-8的含量。说明中药健宫散能够调节部分白细胞介素的表达，提高机体免疫抗炎能力，可作为奶牛产后保健药，用于子宫炎的防治。
　　关键词：健宫散;奶牛;子宫炎;血清;白细胞介素
　　中图分类号： S858.237.2文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）04-0160-04
　　收稿日期：2019-01-02
　　基金项目：国家重点研发计划（编号：2017YFD0502200）。
　　作者简介：张保军（1992—），男，甘肃天水人，硕士研究生，研究方向为动物疾病诊断与防治。E-mail：1058915714@qq.com。
　　通信作者：谷新利，博士，教授，博士生导师，研究方向为中药制剂开发与应用。E-mail：xlgu@shzu.Edu.cn。
　　奶牛由于分娩、泌乳等应激因素的影响，容易引起产后虚弱、免疫机能下降，引發子宫内膜炎[1]。子宫内膜炎是子宫内膜层受到细菌或病毒的感染，引起子宫内膜组织发生炎症的过程[2]。白细胞介素（IL）是介导白细胞间相互作用的细胞因子，在子宫炎症中发挥着重要的免疫调节作用，其水平的高低反映了子宫的免疫状态。研究发现，IL能调节生殖活动并与子宫内膜表面受体结合，调节免疫炎症反应[3]。IL-1浓度高低是判定炎性反应和炎症损伤程度的重要标志[4];IL-2是一种免疫增强剂，参与细胞介导的免疫，与炎症反应有关;IL-8是一种重要的促炎细胞因子，可使中性粒细胞向炎症部位聚集，研究发现，IL-8与子宫炎的发生有关[5]。有学者推测，IL-8的表达水平可能对奶牛子宫内膜炎有预测和监测的效果[6]。
　　中药健宫散由益母草、当归、川芎、五灵脂、桃仁、甘草等药材配伍而成，其组分均有活血祛瘀、抑菌消炎的功效，但抗炎作用目前尚不明确。本试验在前人研究的基础上，对产后子宫炎奶牛进行口服纯中药健宫散处理，检测治疗前后外周血清中IL-1、IL-2、IL-8含量的变化规律，旨在探讨健宫散对子宫炎奶牛的抗炎作用机制，为进一步了解健宫散的临床治疗机制，深入开发利用健宫散提供基础参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 试验对象
　　在新疆维吾尔自治区石河子市西部牧业优良种畜繁育中心奶牛场选择年龄、胎次、产奶量相近，无传染病及寄生虫病的中国荷斯坦奶牛18头，根据B型超声波检查结果，共诊断出健康奶牛6头，子宫炎奶牛12头，记录每头牛的耳号及产犊日期。
　　1.1.2 药品与试剂
　　健宫散（散剂，400 g/袋），由石河子大学动物科技学院中兽医学研究室研制而成，由益母草、当归、川芎、五灵脂、桃仁、甘草等中药组成，方中各药材均购自当地药店。
　　IL-1（货号：E11I0032）、IL-2（货号：E11I0308）和IL-8（货号：E11I0056）检测试剂盒均购自上海Blue Gene生物技术有限公司。
　　1.1.3 主要仪器
　　荷兰Piemed ICAL公司生产的50S型Tringa Vet便携式兽用B型超声波扫描仪，配备3.5/5.0 MHz变频扇扫凸阵探头或线阵探头;Power Wave XS2 Bio Tek酶标仪（型号ELx800，Made in USA）;超低温冰箱（型号FORMA 995），购自Thermo美国赛默飞世尔科技有限公司;微量快速振荡仪（型号QB-9002 Kylin-Bell），购自Lab Instruments公司;离心机（型号H1850R），购自长沙湘仪离心机仪器有限公司;恒温培养箱（型号DHP-9082），购自上海浦东荣丰科学仪器有限公司;数显恒温水浴锅（型号HH-4），购自江苏省金坛市友联仪器研究所;微孔板脱水仪（型号BIOS-401），购自BIOSCIENCE梅奥赛斯（天津）生物科技有限公司;洗板机（型号Wellwash 4 MK2），购自Thermo美国赛默飞世尔科技有限公司。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 试验动物的分组与处理
　　健康奶牛6头作为正常组（A组）;子宫炎奶牛12头，其中6头进行中药治疗作为治疗组（B组），另外6头不进行治疗，作为患病组（C组）。治疗组奶牛每头每天灌服健宫散400 g，每天1次，连续灌服1个疗程（7 d），正常组和患病组不进行任何处理。
　　1.2.2 样品的采集
　　治疗组奶牛灌服健宫散前采血1次，用药中期（即用药3 d时）采血1次，灌药结束后1、4、7、11、1、20 d各采血1次，共采血8次。采血时间为14：00—16：00，正常组、患病组在同一时间采血，采血次数同治疗组。所有供试牛均空腹经尾静脉采取血液5 mL，室温静置自然析出血清，装于1.5 mL离心管中，置于-80 ℃冰箱中待检。
　　1.2.3 检测指标的测定
　　IL-1、IL-2和IL-8含量均采用反向竞争酶联免疫吸附（ELISA）法测定，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。
　　1.2.4 数据的统计分析
　　应用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析，试验数据均以“平均数±标准差”表示。 　　2 结果与分析
　　分别检测A、B、C组奶牛血清中IL-1、IL-2、IL-8的含量，制作相应标准曲线，得出相关系数：IL-1，r2=0.997 29;IL-2，r2=0.999 16;IL-8，r2=0.997 90。血清中IL-1、IL-2、IL-8含量测定结果见表1。
　　从表1可以看出，用药前、用药中和用药后1 d，患病组血清IL-1含量均高于正常组;相比于治疗组差异不显著（P>0.05）;用药后4 d，治疗组IL-1含量与正常组、患病组差异均不显著，用药4 d以后，治疗组IL-1含量显著低于患病组，相比正常组差异不显著。
　　用药前、用药中和用药后1 d，治疗组和患病组血清的IL-2含量均显著高于正常组;用药后4、7、15 d，治疗组1 d以后显著低于患病组;用药后20 d，治疗组与患病组差异不显著;用药1 d以后，治疗组IL-2含量达到正常水平，相比正常组差异不显著（表1）。
　　用药前，患病组IL-8含量显著高于正常组;用药中，相比于正常组和治疗组差异均不显著;用药后，治疗组IL-8含量总体上不断下降，与患病组相比差异显著，治疗组IL-8含量在用药后相比正常组差异不显著（表1）。
　　3 讨论
　　3.1 健宫散治疗前后奶牛血清中IL-1和IL-8含量的变化
　　白细胞介素是一种在淋巴细胞和白细胞之间传递信息的细胞因子，主要由T淋巴细胞、单核巨噬细胞、肥大细胞、血管上皮细胞等多种细胞产生，通过与细胞膜表面的受体蛋白结合，介导机体的细胞免疫和体液免疫。IL-1和IL-8属于促炎细胞因子，参与机体的体液免疫。研究发现，IL-1 可以影响子宫的生理功能，适量的IL-1可促进子宫内膜蜕膜化[7]和炎性分泌物的排出[8]。IL-1是炎症免疫反应的主要诱导剂，感染炎症时，其值有不同程度的增高[9]。IL-8是一种中性粒细胞趋化因子，在炎症反应中起重要作用。胡路锋针对产后1～35 d 子宫炎奶牛血清中的IL-8浓度检测发现，子宫炎组奶牛和正常组奶牛IL-8含量均呈波动式增加，无明显规律[10]。本试验中，子宫炎组奶牛IL-8 含量前半段时间持续上升，而后半段时间呈现波动式增加，这与胡路锋的研究结果[10]略有不同，可能是试验方法的不同和供试牛个体之间的差异所造成的。Fischer等的研究表明，亚临床或临床子宫内膜炎奶牛子宫上皮细胞IL-1β和IL-8 mRNA的表达显著高于健康奶牛，IL-1β和IL-8可用于监测和诊断亚临床子宫内膜炎[11]。张冬波等研究发现，患子宫内膜炎奶牛子宫中IL-8含量均高于正常奶牛[12]。李德军的研究表明，产后49 d内患临床和隐性子宫内膜炎奶牛血清中IL-1和IL-8的含量均升高[13]。Galvo等报道称，子宫内膜炎奶牛IL-1β含量表达在产后1周下降，产后5周和7周有上升趋势，IL-8基因表达在产后7周显著高于健康对照组[14]。本试验表明，用药前患病组、治疗组IL-1和IL-8含量均高于正常组，停药1 d以后患病组IL-1和IL-8含量均显著高于正常组，治疗组和正常组IL-1和IL-8含量分别在停药4 d以后显著低于患病组，本研究结果IL-1和IL-8含量变化规律与李德军的研究[13]一致。
　　陈晓燕等研究发现，益母草浸膏可显著降低产后子宫内膜炎模型大鼠血清中IL-1β的含量[15]。佟建敏等研究了益母草颗粒对人工流产患者炎性因子水平的影响，发现加服益母草颗粒组术后1 d及7 d宫颈黏液中IL-1含量水平显著低于对照组[16]。奚瑾磊等研究发现，当归醇沉物可增强小鼠腹腔巨噬细胞IL-1的分泌[17]。沈维增等研究发现，当归拈痛汤能降低急性痛风性关节炎患者血IL-1、IL-8含量[18]。付彦君等的研究表明，不同剂量天麻川芎可降低自发高血压大鼠血浆心肌炎症因子IL-1β mRNA的表达水平[19]。王桂华等研究发现，桃仁提取物能显著降低急性胰腺炎大鼠血清中IL-8的含量[20]。赵蓓蕾等研究发现，甘草能降低吸烟大鼠血清IL-8的含量[21]。本试验中，停药后7、11、15、20 d治疗组IL-1含量显著低于患病组，治疗组IL-8含量结束用药后显著低于患病组，说明健宫散降低了促炎因子IL-1和IL-8的表达水平，提高了机体的抗炎能力，原因可能是健宫散组方中益母草、当归、川芎、桃仁、甘草等成分发挥了抗炎功效，使得血清IL-1和IL-8含量降低。
　　3.2 健宫散治疗前后奶牛血清中IL-2含量的变化
　　IL-2属于Th1型细胞因子，可诱导T细胞增殖，诱导NK细胞和LAK细胞产生IFN-γ和TNF-α，活化Th细胞、细胞毒性T细胞和单核巨噬细胞[22]，介导细胞免疫。IL-2被认为是一种不利于动物生殖的细胞因子，有报道显示，奶牛在产后早期，体内编码IL-2的基因没有明显表达[8]。张冬波等研究发现患子宫内膜炎奶牛子宫中IL-2含量均高于正常奶牛[12]。韩莉莉等研究发现，宫颈病变患者血清中IL-2的含量水平均随着宫颈病变严重程度的增加而减少[23]。引起子宫内膜炎主要原因之一的胎衣不下属于一种免疫功能性疾病，马清河等研究发现，胎衣不下组奶牛胎盘组织中IL-2的含量极显著高于健康组，IL-2的含量可能与子宫炎症有关[24]。本试验表明，用药前、用药中及用药后1d患病组、治疗组的IL-2含量高于正常组，停药1 d以后患病组IL-2含量显著高于正常组，停药后4、7、11、15 d正常组显著低于患病组，此研究结果与上述研究结果一致。
　　佟建敏等报道称，益母草颗粒能显著提高人工流产后患者宫颈黏液中IL-2的含量[16]。朱邵晴等研究发现，药物中加入当归能够加速IL-2的产生，促进淋巴细胞的增殖，加强免疫[25]。冯永生等研究发现，川芎可显著提高小鼠血清IL-2的含量[26]。吕跃山等研究发现，桃仁总蛋白能提高荷瘤小鼠血清中IL-2的含量[27]。王志国研究了由当归、白芍、川芎等药材组成的当归芍药散对慢性盆腔炎模型大鼠IL-2的影响，发现当归芍药散能增加慢性盆腔炎模型大鼠血清中IL-2的含量[28]。賈书红等研究发现，宫炎净（由益母草、当归、川芎、桃仁、五灵脂、甘草等组成）提取物中生物碱可显著降低子宫内膜炎家兔血清中IL-2的含量[29]。本研究显示，用药后4、7、11、15 d治疗组IL-2含量显著低于患病组，说明健宫散降低了IL-2的含量，此结果与贾书红等的研究结果[29]一致，与佟建敏等的研究结果[16，25-28]不一致，原因可能是健宫散组分的甘草中主要解毒成分甘草甜素的肾上腺皮质激素样作用，降低了机体对各种有毒物质的反应，从而增强肝脏的解毒功能[30]，促使IL-2含量降低。 　　综上所述，中药复方健宫散能够显著降低产后子宫炎奶牛血清中IL-1、IL-2和IL-8的含量，通过调节IL-1、IL-2和IL-8的表达水平，提高机体的免疫抗炎能力，对奶牛产后子宫炎有明显的防治效果。
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