关于肿瘤Wnt信号通路棕榈酰化的综述

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　　摘  要：Wnt信号通路是一条进化上保守的信号通路，可以调节胚胎形成和组织发育等一系列生命过程。WNT蛋白可通过棕榈酰化进行翻译后修饰，对调节WNT蛋白在细胞中的分泌、定位、生物活性和从产生细胞中扩散起着关键作用。Wnt信号调控失衡与人类癌症的发生密切相关，但具体的机制仍不清楚。文章将从Wnt信号途径转导的分子机制、porcupine（Porcn）介导的WNT蛋白的棕榈酰化以及Wnt信号通路在肿瘤中的功能进行探讨。
　　关键词：Wnt信号通路;棕榈酰化;porcupine;肿瘤
　　Abstract： Wnt signal pathway is an evolutionarily conserved signal pathway， which can regulate a series of life processes such as embryonic formation and tissue development. WNT protein can be post-translational modified by palmitoylation， which plays a key role in regulating the secretion， localization， biological activity and diffusion of WNT protein in cells. The imbalance of Wnt signal regulation is closely related to the occurrence of human cancer， but the specific mechanism is still unclear. In this paper， we will discuss the molecular mechanism of Wnt signal transduction， the palmitoylation of WNT protein mediated by porcupine （Porcn） and the function of Wnt signal pathway in tumor.
　　前言
　　作為一种进化上高度保守的信号通路，Wnt信号通路在机体生长、发育、代谢和干细胞维护等生物过程中发挥重要作用，相关研究发现Wnt信号通路失调与癌症等恶性疾病密切相关[1]。在Wnt信号中，分泌的Wnt配体家族成员与一系列细胞表面受体结合，刺激产生了不同的信号级联，包括典型Wnt途径（β-catenin依赖途径）与平面细胞极性通路PCP、Wnt/Ca2+通路的非典型Wnt途径（β-catenin独立途径）[2]。Wnt受体、下游信号转导通路和靶向通路已经被广泛研究，但是对WNT蛋白如何分泌、如何从分泌Wnt的细胞向接收细胞转移的研究还很少。目前，已经知道内质网上的多跨膜O-酰基转移酶Porcn可以指导Wnt蛋白的分泌、成熟和棕榈酰化。在这篇综述中，我们总结并讨论了当前对Wnt酰化的理解，以便为将来该领域的研究提供借鉴。
　　1 Wnt信号通路
　　1982年人类首次从小鼠乳腺癌中分离得到wnt基因（也称int-1，小鼠乳腺癌病毒整合位点1）[3]。小鼠和人均编码19个wnt基因，不同的wnt基因具有特定的表达模式和功能。Wnt信号通路由WNT蛋白、β-catenin等多种信号分子、配体和受体组成，在进化过程中具有保守性。人类WNT家族由19个富含半胱氨酸的分泌糖蛋白组成，长度为350-400个氨基酸，有15个以上的受体或共受体作为配体[4]。
　　1.1 经典Wnt通路
　　破坏复合物（destruction complex）由AXIN、肿瘤抑制性腺瘤性息肉蛋白（APC）、糖原合成酶激酶3（GSK-3）和酪蛋白激酶1（CK1）组成。在没有经典WNT配体的情况下，β-catenin结合到破坏复合物上并被CK1和GSK-3磷酸化，磷酸化后的β-catenin经蛋白泛素化被蛋白酶体降解[5]。但在经典WNT配体的存在下，β-catenin的磷酸化和蛋白酶体降解会被抑制。当WNT配体与FZD受体/LRP共受体结合时，稳定β-catenin的破坏复合物被分解，DVL蛋白结合至AXIN，而后AXIN可抑制破坏复合物中GSK-3磷酸化β-catenin，因此破坏复合物被招募到质膜上形成信号体[6]。β-catenin在细胞质中聚集并定位到细胞核，与DNA结合T细胞因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）转录因子形成核复合体，导致Wnt应答基因的激活。
　　1.2 非经典Wnt通路
　　与β-catenin依赖的典型途径相比，WNT蛋白质能够激活独立于β-catenin以外的信号通路，这些通路被称为非经典通路，可以进一步分为两条不同的路径分支即平面细胞极性（PCP）通路和Wnt/Ca2+通路。
　　PCP通路参与细胞形态发生过程中极性的调控[7]。PCP途径通过WNT配体与FZD受体的结合激活通路，而与LRP共受体无关。非经典途径不需要利用包括Wnt本身在内的大多数经典途径组份，但大多数都涉及DVL和Dvl相关形态发生激活子1（DAAM 1）。在Wnt/PCP信号途径中，Wnt5A激活DVL、JNK和Rho。FZD和DVL与小GTP酶Rho连接，Rho进一步激活Rho相关激酶（ROCK），从而导致细胞骨架重组。Dvl与Rac GTP酶形成复合体，激活了Jun激酶（JNK）的活性[8]。非经典Wnt信号的第二个分支称为Wnt/Ca2+途径。Wnt/Ca2+途径的作用是调节细胞内Ca2+从内质网中的释放，并在原肠胚形成过程中调节背轴形成信号激活原肠胚细胞运动、细胞粘附、迁移[9]。Wnt/Ca2+途径的激活需要WNT配体与FZD受体结合，直接相互作用并激活异源三聚体G蛋白，导致细胞内Ca2+浓度增加。释放的Ca2+然后可以激活钙/钙调蛋白依赖激酶II（CamKII）、钙调磷酸酶或蛋白激酶C（PKC）[10]。 　　2 棕榈酰化
　　棕榈酰化是将16碳饱和脂肪酸棕榈酸酯作为脂质供体连接在蛋白质的一个或多个半胱氨酸残基上（但有时作为一个氧酯附着到丝氨酸）[11]。棕榈酰化不仅可以通过与其他蛋白质的相互作用，将信号分子正确引导到细胞内和细胞间的靶点;还可以通过膜锚定在特定的细胞表面微域/脂质受体，促进信号传递的效率和特异性。
　　2.1 Porcn介导WNT蛋白棕榈酰化
　　 Wnt蛋白必须经过加工和分泌才能发挥作用。WNT蛋白上的棕榈酰化修饰是由位于细胞内质网上的Porcn进行的。WNT蛋白通过棕榈酰化附着至脂质体，继而被输送至细胞质膜完成分泌过程。Wnt细胞外转运的具体机制仍待继续研究，这些可能涉及分泌小泡或外泌体结合。负责棕榈酰化修饰的Porcn是定位于内质网（ER）的膜结合O酰基转移酶（MBOAT）家族中的成员，是一种多次跨膜蛋白[12]。
　　Porcn催化的反应发生在内质网腔中，分两步进行。首先，Porcn催化脂肪酰化反应需要硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1），SCD1的去饱和作用可以将棕榈酰辅酶A变成棕榈油酸辅酶A。然后，棕榈油酸辅酶A是Porcn的底物，Porcn将棕榈油酸辅酶A转移到WNT蛋白的半胱氨酸上，催化反应发生[13]。Porcn可以将13-16个碳的单不饱和脂肪酸连接到WNT蛋白上。尽管已经确定了Porcn具有Wnt酰基转移酶的作用，但目前尚不清楚Porcn是如何识别其脂肪酸底物的以及为什么WNT蛋白发挥功能需要进行棕榈酰化反应。
　　2.2 WNT蛋白的分泌需要棕榈酰化
　　棕榈酰化位点的半胱氨酸突变会导致脊椎动物和果蝇WNT蛋白活性的显著丧失和重新分布。Wntless是一种细胞內跨膜蛋白，通过促进Wnt从高尔基向质膜的运动来促进WNT蛋白的分泌。93位的棕榈酰化是果蝇Wingless（WG）蛋白分泌所必需的，在没有Porcn或棕榈酰化位点的情况下，WG蛋白在内质网中累积但不会分泌。WG的C93A突变体在内质网中积累，表明棕榈酰化对WG的细胞内运输和分泌是必要的。用蛋白棕榈酰化抑制剂2-溴棕榈酸盐处理果蝇S2细胞抑制棕榈酰化作用后，也能阻断WG蛋白向培养基中的有效分泌。未棕榈酰化的WG蛋白分泌减少可能导致蛋白错误折叠以及在内质网中累积。棕榈酰化对WG蛋白分泌的影响可能是由于它能够使WG在高尔基体内形成脂质筏膜微结构域，并且优先输送到质膜。在没有Porcn的情况下，突变的WG的第一个半胱氨酸残基具有一个游离的巯基，可能会干扰其他半胱氨酸的正常二硫键形成，从而导致蛋白质错误折叠并保留下来。WG中大量的半胱氨酸使错误折叠成为应对错义突变的常见反应[14]。
　　2.3 WNT蛋白受体的激活需要棕榈酰化
　　棕榈酰化可以增强某些配体蛋白的信号活性。在培养的细胞中加入等量的非棕榈酰化WNT3A蛋白与其棕榈酰化形式相比，前者的活性显著降低。野生型和WNT3A的C77A突变型（一种非棕榈酰化突变体）均能从稳转细胞的条件培养基中有效地检测到。然而，WNT3A的C77A 突变型导致其与受体LRP6和Frizzled 8的结合能力受损[15]。小鼠WNT3A的棕榈酰化位点的突变不影响其分泌，但减少了其活性，这揭示了WNT棕榈酰化的第二种功能。
　　2.4 棕榈酰化对转运有不同的影响
　　除了影响分泌和信号活性外，WNT/WG蛋白的棕榈酰化也影响细胞外转运过程。通过体外过表达Porcn能增强鸡神经管中Wnt1或Wnt3a的棕榈酰化作用，使Wnt信号梯度变陡，这可能是阻止蛋白从分泌部位向外扩散引起的。WG蛋白与载脂蛋白共同存在时，棕榈酰化促进WG与脂蛋白颗粒结合。一旦与脂蛋白颗粒结合，WG就能够在较长的距离上运动并发出信号[16]。
　　3 Wnt信号通路与肿瘤
　　肿瘤是一类由于基因、表观遗传和细胞水平的逐步改变而持续增殖的疾病，已成为人类健康的巨大威胁。Wnt途径的突变和功能失调与癌症有着密切的联系，Wnt途径的组成部分本身可能起促癌或抑癌作用。Wnt/β-catenin信号通路参与多种人类肿瘤的发生，已成为近年来的研究热点。
　　APC基因的截断突变和结直肠癌有关。在约90%的结直肠癌中，Wnt通路的一个组成部分的激活突变导致结直肠癌的形成，其中80%的突变位于APC上，大多是发生了功能丧失或截断突变[17]。没有活性的APC突变会导致Wnt通路的不适当激活，而APC突变通常是发生在结直肠癌中。APC突变是结直肠癌中Wnt信号的主要驱动因素，这些APC突变经常发生在突变簇区域，该区域仅占整个编码区的10%[18]。与结直肠癌不同，乳腺癌在β-catenin的任何编码基因或破坏复合物的组分中都没有表现出基因改变[19]。乳腺癌中Wnt通路的激活似乎是由分泌的Wnt配体的表达以及可溶性Wnt抑制剂表达下降引起的[20]。
　　在肝细胞癌中，β-catenin的积累与低分化形态、高增殖活性和不良预后有关。肺癌中的Wnt信号也与转移能力的增加有关[21]。肝癌中激活的Wnt突变发生在负调节蛋白AXIN中[22]，AXIN作为β-catenin水平和肿瘤抑制蛋白的负调节因子，AXIN的过度表达抑制肝癌细胞的生长[23]。此外，PKC激活的增加已被证明可以增加黑色素瘤细胞的迁移，而其抑制能够减少黑色素瘤转移和黑色素瘤细胞运动[24]。在黑色素瘤细胞中PKC的激活导致STAT3的激活，从而抑制一些黑色素瘤分化抗原的表达，从而降低了黑色素瘤细胞的免疫原性[25]。
　　4 结束语
　　Wnt信号通路是抗肿瘤治疗的潜在靶点，靶向Wnt信号通路抑制癌症一直是一个研究热点，多种相关的抑制剂已经进入临床实验。同时Wnt信号通路在免疫调节中的功能，也提示靶向该信号通路可能在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用。Wnt信号通路一直被认为是很有希望的肿瘤治疗靶标，第一个Wnt信号通路抑制剂的临床试验正在进行。在肿瘤特别是肝癌发生过程中，APC和β-catenin等下游成分频繁发生突变，许多药物开发工作最初集中在阻断β-catenin/Tcf复合物的活性上。细胞信号通路之间的应答及信号通路网络的研究，对于更精准地靶向治疗策略尤为重要，因此详细研究Wnt信号通路的调控机理、翻译后修饰对Wnt信号通路的调节机制和Wnt信号通路异常在肿瘤发生和发展过程中的功能，都是目前仍待解决的问题。但随着该领域研究的深入进行，将有助于开发出更多新颖的治疗策略或化合物。 　　參考文献：
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