JAK2信号通路介导人恶性黑素瘤A375细胞的自噬和凋亡机制研究

来源:用户上传      作者:余扬

　　[摘要]目的：探討JAK2/STAT3信号通路介导人恶性黑素瘤A375细胞的自噬和凋亡活性，为黑素瘤的发生机制和潜在干预靶点提供理论依据。方法：人恶性黑素瘤A375细胞经复苏和传代后随机分为对照组和JAK2抑制剂干预组，比较两组细胞培养12h、24h、48h和72h的增殖率（采用MTT定量法）及凋亡率（采用流式细胞术），培养72h的细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、LC3B和p-STAT3蛋白相对表达量（采用Western blot法），检测IL-6和TNF-α水平（采用ELISA法），检测Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA相对表达量[采用反转录PCR（RT-PCR）法]。结果：两组培养12h、24h、48h和72h的细胞增殖率比较，干预组各时间点均明显小于对照组，而凋亡率明显大于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。干预组培养72h的细胞p-JAK2和p-STAT3蛋白相对表达量、IL-6和TNF-α水平明显低于对照组，但LC3B蛋白、Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA相对表达量均明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：JAK2/STAT3信号通路异常激活可能是人黑素瘤A375细胞恶性增殖的重要通路之一，靶向干预JAK2/STAT3信号通路可以促进细胞自噬和凋亡活性上调，有望成为临床干预的重要靶点。
　　[关键词]JAK2/STAT3信号通路;黑素瘤;自噬;凋亡;增殖
　　[中图分类号]R739.5    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2020）04-0098-04
　　Abstract： Objective  To study the autophagy and apoptotic activity of human malignant melanoma A375 cells via by JAK2/STAT3 signaling pathway，and provide theoretical basis for pathogenesis of melanoma and potential intervention target. Methods  After recovery and generation，human malignant melanoma A375 cells were randomly divided into the control group and the JAK2 inhibitor intervention group. MTT and flow cytometry were used to detect proliferation and apoptosis rates of cells after cultured for 12， 24， 48 and 72 hours， Western blot was used to detect relative expressions of JAK2， p-JAK2， STAT3， LC3B and p-STAT3 proteins， ELISA was used to detect levels of IL-6 and TNF-α and reverse transcription PCR （RT-PCR） was used to detect relative expressions of Caspase-3 and Bax/Bcl-2 mRNAs. Results  The cell proliferation rate of the intervention group was significantly lower than those of the control group at 12h， 24h， 48h and 72h， while the apoptosis rate was significantly higher than those of the control group， the differences were statistically significant（P<0.05）. What’s more， relative expressions of p-JAK2 and p-STAT3 proteins， IL-6 and TNF-α levels after 72h in the intervention group were both significantly lower than those of the control group， while expressions of LC3B protein， relative expressions of Caspase-3 and Bax/Bcl-2 mRNAs in the intervention group were all significantly higher than those of the control group（P<0.05）. Conclusion  Abnormal activation of JAK2/STAT3 signaling pathway may be one of important pathways for malignant proliferation in human melanoma A375 cells. Targeted intervention of JAK2/STAT3 signaling pathway can promote up-regulations of autophagy and apoptotic activities of cells， which is expected to become an important target for clinical intervention. 　　Key words： JAK2/STAT3 signaling pathway; melanoma; autophagy; apoptosis; proliferation
　　黑素瘤是最常见的皮肤和黏膜恶性肿瘤之一，近年来发病率明显增多，已引起临床的高度重视，早期以手术切除为主，中晚期以化疗和靶向干预为主[1]。黑素瘤的发生与环境变化和基因突变有关，研究发现[2]，细胞恶性增殖、自噬和凋亡活性下降是黑色素瘤发生、侵袭和转移的重要机制。细胞自噬和凋亡是细胞存活、分化和内环境稳态维持的重要方式，受体内外多个基因和信号通路的共同调控，具有较强的程序控制性[3]。JAK2/STAT3信号通路是真核生物体内参与调控细胞增殖、分化、损伤修复、炎症反应、氧化应激、细胞因子表达等重要细胞内途径之一[4]。IL-6和TNF-α是JAK2/STAT3信号通路的重要诱导剂，在多种恶性肿瘤如结直肠癌、黑素瘤、胃癌的发生和发展中发挥重要作用。JAK2/STAT3信号通路的活化既需要炎症因子IL-6和TNF-α的诱导，同时又可加剧炎症因子的释放，形成炎症瀑布样级联反应，参与恶性肿瘤的凋亡和自噬过程。并且，肿瘤细胞的恶性增殖、自噬和凋亡活性之间存在密切联系，增殖活性增强提示肿瘤恶性程度较高，越早发生侵袭和转移;自噬和凋亡是细胞完成自我更新的两种方式，两者间可相互影响。基于此，该研究的主要目的是分析介导JAK2/STAT3信号通路激活参与人恶性黑素瘤A375细胞自噬和凋亡程度，为黑素瘤的发生机制和潜在干预靶点提供理论依据。
　　1  资料和方法
　　1.1 细胞培养：人恶性黑素瘤A375细胞购自上海生工科技有限公司，经常规复苏、传代培养，采用DMEM培养基+10%胎牛血清配成完全培养液培养，置于37℃ 5%CO2培养箱中每3d进行半量或全量换液。待细胞融合度达80%，以0.25%胰酶消化，进行1：2比例传代培养，PBS重悬细胞浓度为1×106/ml进行后续实验。
　　1.2 研究方法：实验分为对照组和JAK2抑制剂干预组，对照组采用人恶性黑素瘤A375细胞正常培养，干预组采用JAK2抑制剂AG-490 3ml与A375细胞联合培养。比较两组细胞培养12h、24h、48h和72h的增殖率及凋亡率，培养72h的细胞JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白相对表达量采用Western blot法，ELISA法检测IL-6和TNF-α水平，免疫荧光标记法检测微管相关蛋白1轻链3（LC3）阳性率，反转录PCR（RT-PCR）法检测Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA相对表达量。
　　1.3 检测方法
　　1.3.1 MTT法检测细胞增殖率：将各组细胞接种于96孔板中，细胞浓度调整为5×103个/孔，分别培养12h、24h、48h和72h，每个时间点设置3个复孔，结果取平均值作为最终结果。每孔加入40μl MTT溶液（美国Sigma公司）于37℃ 5%CO2饱和湿度培养箱中培养4h，弃上清，然后加入150μl DMSO溶液（美国Sigma公司）摇动10min，置于酶标仪（美国Bio-Rad公司）上检测490nm波长的吸光度（OD值），以630nm为参考波长。
　　1.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡率：将两组黑素瘤细胞和培养液根据分组要求进行培养，分别于12h、24h、48h和72h收集细胞反应液并进行离心、PBS液冲洗，然后加入荧光标记的共轭膜联蛋白及碘化丙啶（美国Sigma公司），流式细胞仪（美国BD公司）检测细胞凋亡率。凋亡试剂盒由美国R&D公司提供。
　　1.3.3 Western blot法检测JAK2/STAT3、LC3B蛋白：两组黑色素瘤细胞和不同培养液共培养72h，然后离心、PBS液冲洗，超声碎解细胞后根据BCA蛋白定量试剂盒（美国Sigma公司）提示提取细胞总蛋白，并进行浓度和纯度测定;去除培养基，PBS洗涤细胞，裂解液裂解细胞，冰浴30min，40℃ 1 500r/min离心5min，吸去上层液体，超声波破核，再次离心，取上层液体10μl待测。配胶，上样，电泳，转膜，切膜，封闭液封闭1h，逐次兔抗人JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、微管相关蛋白1轻链3B（LC3B，含LC3Ⅱ、LC3Ⅰ双条带）和内参β-actin一抗（1：2 000，美国sigma公司）、羊抗兔对应二抗（1：500，美国sigma公司）。PBS洗涤、ECL显色、凝胶成像软件行半定量分析，结果以目标蛋白与内参的条带灰度比值表示。
　　1.3.4 ELISA法检测IL-6和TNF-α：收集两组培养72h的细胞，3 000r/min离心15～20min，应用酶联免疫吸附法（ELISA）测定IL-6及TNF-α水平。试剂盒由美国DSL公司提供，严格按说明书步骤进行。
　　1.3.5 RT-PCR法检测Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNAs：利用Trizol试剂提取各组细胞总RNA，测定RNA浓度，将合格的总RNA转录成cDNA，然后进行PCR扩增。上海生工有限公司根据Gene Bank序列合成目标引物序列（见表1），配置反应体系包括cDNA 2μl+上下引物各3μl+Taq聚合酶0.5μl，加入无菌反应水至总体积25μl，参照PCR扩增参数要求设置为95℃ 5min预扩增，（95℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 60s）共30个循环扩增，72℃ 10min结束扩增。收集电泳产物并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，在凝胶成像分析系统中进行半定量分析，结果以目标引物与内参引物的条带灰度比值表示。
　　1.4 統计学分析：采用SPSS 20.0统计软件对计量资料作t检验，不同培养时间的细胞增殖率和凋亡率采用重复测量方差分析;P<0.05为差异有统计学意义。
　　2  结果 　　2.1 两组细胞增殖率比较：干预组培养12h、24h、48h和72h的细胞增殖率（26.4±8.2，31.5±7.9，58.9±10.5，70.8±12.7）%均明显小于对照组（30.8±6.7，49.9±11.4，72.4±14.7，92.5±13.7）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图1。
　　2.2 两组细胞凋亡率比较：干预组培养12h、24h、48h和72h的细胞凋亡率明显大于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。
　　2.3 两组JAK2/STAT3蛋白相对表达量比较：干预组培养72h的细胞p-JAK2和p-STAT3蛋白相对表达量明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）; 但两组JAK2和STAT3蛋白相对表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
　　2.4 两组细胞IL-6和TNF-α表达水平比较：对照组培养72h的细胞IL-6和TNF-α表达水平明显高于干预组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。
　　2.5 两组细胞LC3B蛋白表达情况：干预组培养72h的细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达量明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。
　　2.6 两组细胞Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNAs相对表达量比较：干预组培养72h的细胞Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNAs相对表达量明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。
　　3  讨论
　　恶性黑素瘤是一种由黑素细胞演变而来的高度恶性肿瘤，细胞自噬和凋亡活性下降是参与黑色素瘤恶性生物学行为表达的重要机制之一。细胞自噬和凋亡是真核生物体内细胞存活、分化和维持内环境稳态的重要方式，受体内外多个基因和信号通路的共同调控，具有较强的程序控制性。目前，JAK2/STAT3信号通路已证实在免疫反应和肿瘤的发生机制中发挥十分重要的作用[5]。生理狀态下，JAK2/STAT3大多数处于非磷酸化水平，当机体受外界刺激时可发生瞬时、快速的磷酸化转化，持续时间较短，约6～12h，然后快速消失[6]。JAK2/STAT3通路通过胞内段的酪氨酸蛋白激酶结合位点，与相应受体如IL-6、TNF-α等结合，激活下游各种靶蛋白的酪氨酸残基，发挥相应的生物学效应[7]。IL-6和TNF-α是JAK2/STAT3信号通路的重要诱导剂，在多种恶性肿瘤如结直肠癌、黑素瘤、胃癌的发生和发展中发挥重要作用[8-9]。
　　本实验结果提示，JAK2抑制剂干预人恶性黑素瘤A375细胞后，各培养时间点的细胞增殖率较对照组明显下降，而凋亡率则明显升高，提示JAK2/STAT3信号通路是参与黑色素瘤恶性增殖的重要途经之一，而JAK2是靶向干预该信号通路的重要节点[10]。STAT是JAK激酶的重要底物，STAT活化后通过多聚体结合形式存在并穿过核膜与特异性DNA反应元件结合，启动下游目的基因的转录，促使细胞外信号向细胞内转导，最终发挥调控细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节等功能[11]。研究证实，STAT3具有双向调节功能，在不同的恶性肿瘤中可能发挥不同甚至相关的激活效应，在黑素瘤细胞中通过阻断JAK2/STAT3通路可明显降低p-JAK2和p-STAT3蛋白的相对表达量，而对总蛋白JAK2和STAT3影响较小。提示磷酸化状态的JAK2/STAT3对影响黑色素瘤的恶性增殖活性具有更加重要的作用[12-13]。
　　JAK2/STAT3信号通路的活化既需要炎症因子IL-6和TNF-α的诱导，同时又可加剧炎症因子的释放，形成炎症瀑布样级联反应，参与恶性肿瘤的凋亡和自噬过程[14]。本研究结果提示，对照组培养72h的细胞IL-6和TNF-α水平高于干预组，干预组LC3B蛋白、Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA相对表达量均明显高于对照组。关于细胞自噬机制和活性分子研究最多的是LC3蛋白、Atgl2与Atg5复合体等形成，其中LC3Ⅰ和LC3Ⅱ主要参与自噬体的形成，LC3Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3Ⅱ，主要定位于自噬体膜上，其含量与自噬体数目成正相关[15-16]。自噬和凋亡是细胞完成自我更新的两种方式，两者间可相互影响。细胞凋亡是一种精密调节的程序化细胞死亡过程，研究发现细胞内存在多条调控细胞凋亡的信号通路，如线粒体依赖或非线粒体依赖途径，Caspase家族是决定细胞凋亡方向和活性的最终通路[17-18]。凋亡的实现是通过一系列蛋白酶级联式激活和切割的过程，其中Caspase-3被称为死亡蛋白酶，主要发挥对蛋白激酶、核酸酶及细胞骨架的裂解，产生核皱缩、DNA片段等，最终控制凋亡的发生和发展[19]。Bax/Bcl-2比值可影响细胞的凋亡方向和程度，当抗凋亡分子Bcl-2/促凋亡分子Bax≥50%时，细胞表现明显的抗凋亡效应[20]。
　　综上所述，JAK2/STAT3信号通路异常激活可能是人黑素瘤A375细胞恶性增殖的重要通路之一，靶向干预JAK2/STAT3信号通路可以促进细胞自噬和凋亡活性上调，有望成为临床干预的重要靶点。
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　　[收稿日期]2019-11-28
　　本文引用格式：余扬.JAK2信号通路介导人恶性黑素瘤A375细胞的自噬和凋亡机制研究[J].中国美容医学，2020，29（4）：98-101.
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