地西他滨诱导人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡机制的研究

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　　[摘要] 目的 研究地西他濱诱导人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡的机制。 方法 常规体外培养人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞株，取对数生长期的细胞传代24 h后加入不同浓度（0.5、1.0、5.0及10.0 μmol/L）地西他滨处理，分别继续培养24、48、72 h后，用CCK-8法测定细胞增殖活性;倒置显微镜下观察细胞形态;Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测地西他滨作用后人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞株的凋亡率;应用透射电镜观察人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞发生凋亡的形态学特征;实时荧光定量Real time-PCR法检测凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2在mRNA水平表达变化的情况。 结果 地西他滨可以抑制Jurkat细胞增殖，并且呈浓度和时间依赖性（P<0.05）。倒置显微镜观察到地西他滨作用后细胞形态发生了显著改变;流式细胞术检测细胞凋亡的结果表明地西他滨能够诱导人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡并且呈浓度依赖性（P<0.05）;透射电镜观察结果证明地西他滨可以诱导人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞出现凋亡性细胞死亡，5.0 μmol/L地西他滨作用Jurkat细胞72 h后出现大量凋亡小体。另外，Real time-PCR实验研究结果发现地西他滨能够上调促凋亡基因Caspase-3的表达，下调凋亡抑制基因Bcl-2的表达。 结论 地西他滨能通过上调促凋亡基因Caspase-3的表达和下调凋亡抑制基因Bcl-2的表达诱导细胞凋亡。
　　[关键词] 地西他滨;急性淋巴细胞白血病;Jurkat细胞;凋亡
　　[中图分类号] R733.7          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）01-0026-05
　　Study on the mechanism of apoptosis induced by decitabine in human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cells
　　ZHANG Gang1   GAO Xiaohui2   WU Haibing1   ZHAO Xiaoyan1   YAN Minchao1   LI Yuan1   ZENG Hui1
　　GUO Xiaojun1
　　1.Department of Hematology， the First Affiliated Hospital of Jiaxing University， Jiaxing   314000， China; 2.Department of Pediatrics， the First Affiliated Hospital of Jiaxing University， Jiaxing   314000， China
　　[Abstract] Objective To study the mechanism of apoptosis induced by decitabine in human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cells. Methods Human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cell line was routinely cultured in vitro. cells were harvested in logarithmic growth phase， and then treated with different concentrations （0.5， 1.0， 5.0 and 10.0 μmol/L） of decitabine after passage for 24 h. The cells were cultured continuously for 24， 48， and 72 hours respectively. The cell proliferation activity was measured by CCK-8 method. Cell morphology was observed under inverted microscope. Annexin V-FITC/PI staining flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cell line after decitabine treatment. The morphological characteristics of apoptosis in human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cells were observed by transmission electron microscopy. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of apoptosis-related genes Caspase-3 and Bcl-2. Results Decitabine inhibited Jurkat cell proliferation in a concentration-and time-dependent manner （P<0.05）. Inverted microscopy showed significant changes in cell morphology after decitabine treatment. Flow cytometry detection of apoptosis showed that decitabine can induce apoptosis in human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cells in a concentration-dependent manner（P<0.05）. Transmission electron microscopy showed that decitabine can induce apoptotic cell death in human acute lymphoblastic leukemia Jurkat cells， and a large number of apoptotic bodies appeared in Jurkat cells treated with 5.0μmol/L decitabine for 72 h. In addition， real time-PCR experimental results showed that decitabine can up-regulate the expression of the proapoptotic gene Caspase-3 and down-regulate the expression of the apoptosis-inhibiting gene Bcl-2. Conclusion Decitabine can induce apoptosis of cells by up-regulating the expression of apoptosis-promoting gene Caspase-3 and down-regulating the expression of apoptosis-inhibiting gene Bcl-2. 　　[Key words] Decitabine; Acute lymphoblastic leukemia; Jurkat cells; Apoptosis
　　急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是由于原始淋巴细胞及幼稚淋巴细胞在造血组织异常增殖，并浸润全身各组织脏器（尤其是肝、脾、淋巴结、脑脊液、睾丸、胸腺等组织脏器）的一种常见血液系统恶性肿瘤[1]。在儿童与成人群体中均可发病，目前已经成为儿童期最常见的恶性肿瘤[2]。而且ALL是全球范围内发病率高、致死率高的恶性肿瘤之一，仅仅在美国每年有大约27 000例被诊断为ALL，12 000例因ALL死亡[3]。随着诊断技术水平的不断提高及治疗方案的不断更新，特别是造血干细胞移植技术在临床上的广泛应用，ALL患者的治愈率有了明显提高[4]。尽管如此，仍有20%的患者将会面临复发、死亡等风险[5]。因此，寻找一种更有效的抗ALL治疗方法至关重要。
　　目前地西他滨（decitabine，DAC）在治疗成人急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）、骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）等恶性疾病方面在临床上已得到了广泛的认可及推广[6-7]，但在临床上尚未用于急性淋巴细胞白血病的治疗。本研究中我们依据现有的研究结果，结合当前抗急性淋巴细胞白血病研究的新热点，探讨了地西他滨是否具有诱导人ALL Jurkat细胞凋亡的作用及其可能的分子机制，为ALL的治疗提供新靶点、新思路。
　　1 材料与方法
　　1.1 主要试剂和仪器
　　地西他滨（江苏正大天晴药业股份有限公司）溶于生理盐水，-20℃保存，使用时用生理盐水稀释至工作浓度;人ALL Jurkat细胞、青霉素、链霉素、70%乙醇、0.25% Tripsin-EDTA、PBS、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、50×TAE电泳缓冲液（江苏凯基生物技术股份有限公司）;Cell Counting Kit-8（日本 DOJINDO Laborataries）;RPMI-1640培养基（美国 GIBCO）;FBS（美国 ExCell Biology）;氯仿、异丙醇（中国 京化学试剂有限公司）、cDNA第一链合成试剂盒、Taq DNA Polymerase（美国 Thermo Fisher）、96 wellcell culture plate、6 wellcell culture plate、24 wellcell culture plate（美国 Corning Incorporated）;超净工作台（中国 苏州净化）;通风橱（中国 苏州亿达）;CO2培养箱（日本 SANYO）;2.5 μL、10 μL、200 μL、1000 μL移液器（德国 eppendorf）;生物倒置显微镜（日本OLYMPUS）;振荡器（中国 上海沪西分析仪器厂）;台式低速离心机（中国 上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂）;立式压力锅（中国 上海博讯）;电热鼓风干燥箱（中国 上海圣欣）;酶标仪（美国 BioTek）;恒温水浴箱（中国 常州国华电器有限公司）;高速冷冻离心机（德国 Sorvall）;多用脱色摇床（中国 江苏金坛市正基仪器厂）;紫外光度仪（日本SHIMADZU）;普通梯度PCR仪（美国 ABI Veriti 96 well Thermal cycler）;荧光定量PCR循环仪（中国 中山达安）。
　　1.2 培养细胞
　　将符合细胞计数要求的ALL Jurkat细胞株悬液分装入含有10%灭活胎牛血清的RPMI 1640培养基的培养瓶内，并将培养瓶放在37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养。每2～3天更换1次细胞培养基并传代一次，并取对数生长期的细胞用于实验。
　　1.3 CCK-8法检测细胞增殖
　　取对数生长期的ALL Jurkat细胞株接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞数调整为5×104个，每孔加入200 μL相應的含有不同浓度地西他滨的培养基，使地西他滨终浓度分别为0.5、1.0、5.0及10.0 μmol/L，并设立未加药的阴性对照组，每种浓度设5个复孔。置于37℃，5% CO2培养箱中培养24、48和72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱内继续培养3 h，摇床10 min轻轻混匀;λ=450 nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率;IR（%）=[（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值]×100%，计算各组别抑制率及药物IC50。
　　1.4 倒置显微镜观察Jurkat细胞形态的变化
　　取对数生长期的ALL Jurkat细胞株接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞数调整为5×104个，每孔加入200 μL相应的含有不同浓度地西他滨的培养基，使地西他滨终浓度分别为0.5 μmol/L和5.0 μmol/L，并设立未加药的阴性对照组，每种浓度设5个复孔。置于37℃，5% CO2培养箱中继续培养72 h后，倒置显微镜下观察细胞生长状态及形态学改变。
　　1.5 Annexin-V FITC/PI双染法检测细胞凋亡
　　按试剂盒说明书进行操作，取对数生长期的ALL Jurkat细胞株接种于6孔板中，培养24 h后，根据组别设置分别加入地西他滨终浓度分别为0.5 μmol/L和5.0 μmol/L的培养基，并设立未加药的阴性对照组;药物作用72 h后，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集细胞;用PBS洗涤细胞2次（离心2000 rpm，5 min）收集5×105细胞;加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞;加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL PI（Propidium Iodide），混匀;室温、避光、反应5～15 min，加入结合缓冲液后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率的情况。 　　1.6 透射电镜观察亚细胞结构
　　（1）取材：取对数生长期的ALL Jurkat细胞株，将细胞密度调至1×105个/mL接种于75 mL培养瓶中，培养24 h后，实验组分为3组，每孔加入浓度为5.0 μmol/L的地西他滨培养液，继续培养72 h;阴性对照组加入等量的1640完全培养基。取对照组和实验组细胞，PBS洗涤一遍，离心（2000 rpm，15～20 min）于EP管底部。（2）固定：2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2 h或更长时间，用0.1 M磷酸漂洗液漂洗15 min 3次，1%锇酸固定液固定2～3 h用0.1 M磷酸漂洗液漂洗15 min 3次;（3）脱水：50%乙醇15～20 min，70%乙醇15～20 min，90%乙醇15～20 min，90%乙醇、90%丙酮（1：1）15～20 min，90%丙酮15～20 min，以上在4℃冰箱内进行100%丙酮室温15～20 min 3次;（4）包埋：纯丙酮+包埋液（2：1）室温 3～4 h，纯丙酮+包埋液（1：2）室温过夜，纯包埋液37℃ 2～3 h;（5）固化：37℃烘箱内过夜，45℃烘箱内12 h，60℃烘箱内24 h;（6）LKB-1型超薄切片机切片 50～60 nm;（7）3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色;（8）透射电镜观察拍片。
　　1.7 Real time PCR法检测Caspase-3、Bcl-2在mRNA的表达水平
　　实验组加入地西他滨，浓度分别为0.5 μmol/L和5.0 μmol/L;用试剂盒提取细胞总RNA，测定其浓度和纯度。按照美国Thermo Fisherc公司的DNA第一链合成试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA第1链，cDNA第一链合成体系20 μL：取灭过菌且无核酸酶的0.2 mL PCR管，依次加入如下组份：RNA（2 μg）2 μL、Oligo dT（18）2 μL、无核酸酶的双蒸水至总体积12.5 μL;65℃保温5 min，然后冰浴5 min;往上步骤中的0.2 mL PCR管依次加入如下组份：RNase抑制剂（40 U/μL） 0.5 μL、5×ReactionBuffer 4.0 μL、dNTPs（10 mM）2.0 μL、M-MuLV 1.0 μL;轻轻混匀后，然后2000 rpm离心20 s;先在42℃保温1 h，然后70℃保温10 min，然后置于冰上5 min;上述产物可立即进行下一步的PCR反应或-20℃保存。将制备好的cDNA进行PCR扩增，扩增体系如下：反应参数：95℃ 10 min，然后95℃，15 s和60℃ 45 s 40个循环。PCR引物序列由南京凯基生物科技发展有限公司验证并合成，选择GAPDH为内参照。各基因引物序列见表1。
　　1.8 统计学处理
　　应用SPSS18.0软件完成统计学处理，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组比较，应用单因素方差分析，以α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 不同剂量地西他滨对Jurkat细胞增殖的影响
　　地西他滨作用于ALL Jurkat细胞株24 h后，细胞增殖均受到不同程度地抑制，呈剂量-时间依赖性，随着地西他滨浓度的增加及时间的延长，抑制率呈上升趋势，与未加药的阴性对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。表2可见，随着地西他滨浓度的增加和时间延长其抑制作用显著增强，72 h抑制率较48 h、24 h明显增高（P<0.05）。72 h和48 h时地西他滨的IC50分别为1.145 μmol/L和6.044 μmol/L。
　　2.2 地西他滨对Jurkat细胞形态学改变的影响
　　未加药的阴性对照组：未加用地西他滨的ALL Jurkat细胞株生长良好，形状不规则，呈梭形或多角形，细胞核大，核异型，核质比高，可见异常核分裂;地西他滨最终浓度分别为0.5 μmol/L和5.0 μmol/L的實验组：地西他滨作用Jurkat细胞72 h后与对照组相比细胞形态发生明显变化（细胞皱缩明显，细胞密度显著减小），且高浓度组细胞形态变化更加显著，细胞变小变圆，且细胞内颗粒明显增多。见封三图1。
　　2.3 地西他滨对Jurkat细胞凋亡率的影响
　　不同浓度的地西他滨作用Jurkat细胞72 h后，细胞发生凋亡，且随药物浓度加大，凋亡率明显增高，呈浓度关系;与对照组相比，差异有统计学意义。地西他滨0.5 μmol/L、5.0 μmol/L作用于Jurkat细胞72 h后，细胞凋亡率发生明显的变化，分别为（35.20±1.20）%和（65.35±1.78）%。见表3、图1。
　　2.4 地西他滨对Jurkat细胞超微结构改变的影响
　　阴性对照组A：Jurkat细胞超微结构基本正常，个别细胞胞浆内含脂滴，核膜完整（图2A）。地西他滨组B：其胞质中可见明显凋亡现象，5.0 μmol/L的地西他滨用药72 h后的细胞中，部分细胞线粒体损伤较为明显，可见细胞核中的染色质颗粒向异染色质区集中，其电子密度高于正常，核仁消失，核膜完整及凋亡小体形成等特征（图2B）。
　　2.5 地西他滨对Jurkat细胞凋亡相关基因Caspase-3、 Bcl-2表达的影响
　　用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术在mRNA水平检测Caspase-3、Bcl-2的表达变化情况。结果发现，地西他滨作用于ALL Jurkat细胞72 h后，Caspase-3基因表达上调，Bcl-2基因表达下调，且呈浓度依赖关系。Caspase-3、 Bcl-2的表达水平的变化与细胞凋亡活动的变化具有水平相关性，由此推断地西他滨诱导ALL Jurkat细胞的凋亡与Bcl-2表达下调、Caspase-3表达上调有关。见表4。 　　3 讨论
　　细胞凋亡又称程序性细胞死亡，细胞凋亡过程相当复杂，有多条信号通路及多基因参与，其中Bcl-2和Caspase系列基因被称为是最经典的细胞凋亡通路[8]。Bcl-2家族是一类在细胞凋亡信号途径中发挥重要作用的蛋白质，Bcl-2是Bcl-2家族中最有代表性的凋亡抑制基因，在很多恶性肿瘤中大量表达（如胃癌、白血病等），且在肿瘤细胞凋亡过程中发挥了重要的调控作用[9]。因为抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax形成异源二聚体时具有抑制Bax蛋白活性的功能，所以当Bax形成同源二聚体时具有诱导细胞凋亡的活性，同时Bcl-2蛋白表达量也会增加，而当同源二聚体Bax分开，其与Bcl-2形成异源二聚体时，则能够抑制细胞凋亡[10-11]。Czabotar PE等[12]研究结果显示Bcl-2具有通过促进细胞生存的途径从而抑制细胞凋亡的作用，且过度表达将会使正常机体内细胞凋亡，降低发生肿瘤的风险。Caspase-3是蛋白凋亡家族Caspase中的重要一员，其本质是一种核酸内切酶，具有执行细胞凋亡的功能，当Caspase-3蛋白酶活性被激活后，细胞就会发生不可逆的凋亡[13-14]。研究表明，在多种肿瘤细胞发生凋亡时，Caspase-3蛋白都会出现表达上调[15-16]。相关研究结果显示通过诱导白血病细胞凋亡的方法治疗白血病与应用传统抗肿瘤化疗药物相比具有毒副作用更小、疗效更加显著的优势[17]，所以积极探寻诱导白血病细胞凋亡的新型药物是目前治疗白血病主要研究热点、方向。
　　地西他滨（decitabine，DAC）是一种表观遗传学抑制剂，主要是通过磷酸化后直接掺入DNA，抑制DNA甲基化转移酶，引起DNA低甲基化从而恢复控制细胞分化增殖基因的正常功能来发挥抗肿瘤作用。目前地西他滨（decitabine，DAC）在治疗成人急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）、骨髓增生異常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）方面在临床上已得到了广泛的应用，且已有研究报告显示地西他滨对K562、MEL、S579等细胞株都具有抑制增殖、诱导其凋亡的作用[18]，但关于地西他滨对ALL Jurkat细胞株的作用研究很少，本研究结果表明，不同浓度的地西他滨对ALL Jurkat细胞株均具有不同程度的增殖抑制作用，且随着地西他滨药物浓度增加及作用时间延长其抑制作用增强，呈现药物浓度和作用时间依赖性。通过流式和透射电镜实验结果进一步表明了地西他滨具有诱导ALL Jurkat细胞株凋亡的作用，这与王怡等[19]研究结果是相一致的。本研究还发现地西他滨可呈浓度依赖性下调抗凋亡基因Bcl-2表达及上调促凋亡基因Caspase-3在mRNA水平的表达，这与刘进等[20]实验研究结果是一致的。
　　综上所述，地西他滨能够显著抑制ALL Jurkat细胞株的增殖，并诱导其凋亡，而下调抗凋亡基因Bcl-2表达和上调促凋亡基因Caspase-3 mRNA的表达水平可能是其分子机制，可为地西他滨应用于ALL 的临床治疗提供实验理论依据。
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　　（收稿日期：2019-07-15）
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