正交设计优选金银花超声提取工艺

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　　摘 要：本文以正交设计优选金银花总黄酮的超声提取工艺。试验以金银花总黄酮为考察指标，在单因素实验基础上，采用L9（34）正交试验设计，对料液比、超声功率、超声次数、乙醇浓度4个参数条件进行优化，以分光光度法测定金银花总黄酮含量，得出最佳提取工艺参数。单因素考察结果显示，超声次数在120次、料液比为1∶40、超声功率为120W、乙醇浓度为50%时，出现极值或最值。正交试验结果表明：4因素对总黄酮提取率影响大小依次为超声次数>料液比>乙醇浓度>超声功率。由此可以得出，超声提取金银花总黄酮的最佳工艺条件为料液比为1∶30，超声功率为120W，超声次数为120次，乙醇浓度为50%。以超声法提取金银花总黄酮操作简易，提取率高，适合工业生产。
　　关键词：金银花;总黄酮;超声提取;正交设计
　　中图分类号：S-3       文献标识码：A
　　DOI：10.19754/j.nyyjs.20200430007
　　 金银花（Lonicera japonica Thunb），是忍冬科植物忍冬及同属植物干燥花蕾或带初开的花[1]。因其能够疏散风热、清热解毒，故临床常用于风热感冒、热毒疮痈、咽喉肿痛等症的治疗，效果良好。金银花含有黄酮类[2，3]、挥发油类[4]、有机酸类[5]等多种化学成分。现代药理研究表明，黄酮类化合物具有保护心肌、降血压、提高免疫功能、抗肿瘤等多重效用[6]。目前，对于金银花总黄酮的研究也在不断深入，研究发现金银花总黄酮在抑菌[7]、抗氧化[8]及保护肝脏[9，10]等方面效果良好，是金银花的主要活性成分。金银花总黄酮的提取方法较多，包括超临界CO2萃取法[11]、超声提取法[12]、溶剂提取法[13]、微波提取法[14]等，其中超声提取法具有操作简单、消耗时间少、溶剂用量少等优点，节能环保，适合金银花总黄酮的提取及其工业化生产。鉴于此，本文拟采用超声法提取金银花总黄酮，在单因素考察的基础上进行正交试验，以期得到最佳提取工艺，为金银花总黄酮的高效提取利用及后续研究奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　紫外-可见分光光度计（美国BECKMAN）;超声破碎仪（江苏天翎公司）;电热恒温水浴锅（上海一恒公司）;万分之一电子天平（天津智博联公司）;恒温干燥箱（上海益恒公司）;金银花（亳州众益堂中药材公司，干燥备用）;芦丁对照品（购自中国食品药品检定研究院，批号100080-201811，供含量测定用）;氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、甲醇、乙醇等均为分析纯，水为超纯水。
　　1.2 方法
　　1.2.1 芦丁对照品储备液的配制
　　精密称取芦丁对照品10mg，置于10mL棕色容量瓶中，加入60%甲醇振荡并水浴加热溶解，再以60%甲醇稀释至刻度，摇匀，得到1μg/μL的芦丁对照品储备液。
　　1.2.2 芦丁标准曲线的制备
　　精密吸取对照品储备液150μL、200μL、250μL、350μL、450μL、550μL、650μL于10mL容量瓶中，各加水至1mL。再加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，静置6min;加入10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，静置6min;加4%氢氧化钠溶液4mL，用水稀释至刻度，摇匀，静置15min。分别制成15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、35μg/mL、45μg/mL、55μg/mL、65μg/mL的芦丁对照品溶液。以0μg/mL为空白对照液，于510nm波长处测定各浓度芦丁对照品溶液的吸光度，以浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标进行线性回归，得标准曲线方程。
　　1.2.3 总黄酮的提取及含量测定
　　称取干燥金银花1.00g于干燥锥形瓶中，按單因素考察和正交试验设计各参数，设定超声次数、超声功率、料液比及乙醇浓度进行提取。提取液经补重后过滤，取续滤液。移取续滤液1mL至10mL容量瓶中，以水稀释至刻度;取稀释液1mL至10mL容量瓶中，按“1.2.2”下同法显色，取稀释液1mL至10mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，作参比[15]，于510nm波长处测定供试品溶液的吸光度，据回归方程计算黄酮得率：
　　总黄酮提取率Y（%）=C×V×NM×1000×100%
　　式中，C指提取液中总黄酮的质量浓度（μg/mL），V指的是提取液的体积（mL），M为金银花的质量（g），N为稀释倍数[16]。
　　1.2.4 单因素考察设计
　　超声提取总黄酮影响较大的因素有料液比、超声功率、超声次数（时间）、乙醇浓度等，对上述4因素进行单因素考察，具体如下。
　　1.2.4.1 料液比对总黄酮得率的影响
　　称取干燥金银花1.00g于锥形瓶内，设置超声时间参数（超声工作3s、间隔5s），以乙醇浓度为60%、超声功率100W分别在料液比为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70下工作100次（合超声时间300s），分别测定吸光度并计算黄酮得率。
　　1.2.4.2 超声次数（时间）对总黄酮得率的影响
　　称取干燥金银花1.00g于锥形瓶内，设置超声时间参数（超声工作3s、间隔5s），以乙醇浓度为60%、超声功率100W、料液比为1∶40下分别工作40、60、80、100、120次，分别测定吸光度并计算黄酮得率。
　　1.2.4.3 超声功率对总黄酮得率的影响
　　称取干燥金银花1.00g于锥形瓶内，其它条件一致（料液比1∶40、乙醇浓度50%、超声工作100次），用40、60、80、100、120W的超声功率进行提取，分别测定吸光度并计算黄酮得率。
　　1.2.4.4 乙醇浓度对总黄酮得率的影响
　　称取干燥金银花1.00g于锥形瓶内，其它条件一致（料液比1∶40、超声功率100W、超声工作100次），用乙醇浓度为30%、40%、50%、60%、70%进行提取，分别测定吸光度并计算黄酮得率。 　　1.2.5 正交试验设计
　　在单因素考察的基础上，进行4因素3水平L9（34）的正交试验，每组制备3个样品待测，并对最优组合进行验证，以期优化超声提取金银花总黄酮的工艺条件（实验因素水平及编码设计见表1）。
　　
　　2 结果与分析
　　2.1 芦丁标准曲线绘制结果
　　根据“1.2.2”实验结果，以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C，μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程A=0.0123C-0.0082（R2=0.9995，n=7）（见图1）。表明芦丁对照品在15～65μg/mL范围内吸光度呈良好的线性关系。
　　
　　2.2 单因素考察试验结果
　　2.2.1 料液比对总黄酮得率的影响
　　料液比影响如图2所示。随着液体量的变化，金银花总黄酮提取率受到显著影响。由图2可知，当料液比为1∶40时黄酮得率最大，料液比超过1∶40后，黄酮得率在下降，可能是由于液体量过大致使超声的空化效应减弱，对金银花细胞的破碎受限，造成黄酮溶出减少。
　　
　　2.2.2 超声次数（时间）对总黄酮得率的影响
　　超声次数影响如图3所示。在超声次数为40～120次即超声时间为120～360s时，随着超声时间的延长金银花总黄酮提取率在不断升高，当超声次数超过100次时曲线变化不明显，可能是长时间的超声波热效应及机械效应对黄酮的结构产生了破坏。
　　
　　2.2.3 超声功率对总黄酮得率的影响
　　超声功率影响如图4所示。随着超声功率的增加，总黄酮提取率也在不断上升，功率在40～80W坡线较陡，增长较快，可能因为随着功率的增加，空化效应增强，使得金银花细胞破碎量增多，总黄酮的析出量增大。功率高于80W之后，虽然提取率还在增加，但是趋势逐渐平缓，随着超声功率的逐渐升高，可能会破坏总黄酮结构。另外，还可能使得金银花中其它杂质的析出增多，造成有效成分不易提纯。故选120W为最佳。
　　
　　2.2.4 乙醇浓度对总黄酮得率的影响
　　乙醇浓度影响如图5所示。由图5可知，当乙醇浓度为50%时黄酮得率最大，超过50%后黄酮得率减小，可能是高浓度的乙醇限制了黄酮类化合物的溶出，致使其被阻隔在了细胞内。
　　
　　2.3 正交试验结果
　　
　　由表2分析可知，极差最大的因素是超声次数，其次是料液比和超声功率，极差最小的是乙醇浓度，表明影响金银花总黄酮得率的主次因素为超声次数>料液比>超声功率>乙醇浓度。由各因素水平可得最优组合为A1B2C3D3，即在料液比为1∶30、乙醇浓度为50%、超声功率为120W条件下超声120次，测得此组合實验金银花总黄酮的提取率为18.83%。
　　3 讨论
　　现代药理研究明确金银花在多种疾病的预防和治疗方面卓有成效[17]，提高金银花中有效成分的提取率可以为金银花资源的高效可持续利用提供有力保障。本实验采用超声提取法并正交设计优选出金银花总黄酮的提取工艺参数，利用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定总黄酮含量，优化组合的总黄酮得率高达18.83%，相较于其它提取方法[11，12，18，19]有显著提高。传统的加热回流提取工艺温度过高，会破坏黄酮结构，使有效成分的稳定性降低。本法操作简单，污染小，节约资源，经济方便，可应用于工业生产，同时也为金银花资源的高效开发利用提供参考依据。有学者创新性地提出通过静电场来加强超声波的空化效应[20]，以期达到提高有效成分提取率的目的，此举也为中药材资源的高效开发利用提供了新思路。
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　　（责任编辑 李媛媛）
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