超声辅助提取泡桐叶熊果酸工艺研究

来源:用户上传      作者:陈静 董家新 赵丰丽

　　摘要 [目的]采用超声辅助提取泡桐叶中熊果酸，为泡桐熊果酸的开发利用提供基础。[方法]通过单因素试验和正交试验研究乙醇浓度、提取时间、提取温度、料液比、超声波功率和提取次数对熊果酸得率的影响。[结果]经方差分析和验证试验确定了从泡桐叶中提取熊果酸的最佳提取条件为乙醇浓度90%、料液比1∶20（g∶mL）、提取时间40 min、提取温度65 ℃、提取次数3次、超声波功率350 W，在该提取工艺条件下熊果酸得率为0.742%。[结论]超声法提取是一种效率高、条件温和且操作简单的大众化的提取熊果酸的方法。
　　关键词 泡桐叶;熊果酸;超声波辅助;提取;正交试验
　　Abstract [Objective]In order to provide a basis for the development and utilization of ursolic acid from Paulownia tomentosa， ultrasonic assisted extraction was adopted to extract the ursolic acid from Paulownia tomentosa. [Method] The efects of ethanol concentration， extraction time， extraction temperature， solidliquid ratio， ultrasonic power and extraction times on the yield of ursolic acid were studied by single factor and orthogonal experiments. [Result]The optimum extraction conditions of ursolic acid from Paulownia tomentosa leaves were determined by variance analysis and validation test， the concentration of ethanol was 90%， the solidliquid ratio was 1：20， the extraction time was 40 min， the extraction temperature was 65 ℃， the extraction times was 3 times， and the ultrasonic power was 350 W. Under the condition of the extraction process， the ursolic acid yield was 0.742%. [Conclusion]Ultrasound extraction is a popular method to extract ursolic acid with high efficiency， mild conditions and simple operation.
　　Key words Paulownia tomentosa leaves;Ursolic acid;Ultrasonicassisted;Extraction;Orthogonal experiment
　　熊果酸（ursolic acid），別名乌索酸和乌苏酸。纯品是棱柱状或细毛样针状结晶，有光泽，粗品为黄绿色或棕黄色粉末，有特殊气味，是存在于天然植物中的一种五环三萜类化合物[1]，具有抗癌[2]、抗氧化美白[3]、抗菌抗炎[4]、降糖[5]等多种药理作用，目前备受关注。有关熊果酸的提取近年来已成为天然产物开发领域的研究热点，我国泡桐资源丰富，熊果酸又是其主要的功能性成分之一[6]，从泡桐中提取熊果酸，充分利用泡桐资源，具有重要意义。
　　熊果酸的提取方法很多，目前从各种原料中提取熊果酸的方法主要有回流提取法[7]、索氏提取[8]、浸提法[9]、超声波提取法[10]、微波提取[11]、超临界萃取法[12]、亚临界水萃取[13]、双水相萃取法[14]、常温超高压提取法[15]、沉淀吸附法[16]、微波预处理-回流提取联合工艺法[17]等。实验室常用的主要是回流法、索氏提取法、微波辅助提取以及超声辅助法，其中微波提取法升温较快，对产物生物活性不利，而回流提取法、浸提法和索氏提取所用时间较长、效率低下，其他方法如超临界流体萃取等萃取法和超高压提取法等对设备要求高、成本高。因此该研究主要采用超声辅助提取法，鉴于目前熊果酸提取的影响因素缺少全面研究，大多只研究了乙醇浓度、料液比、提取时间和温度4个因素[7-11]，提取所用溶剂主要是乙醇，少数用甲醇[18-19]和丙酮[20]。该研究以毛泡桐（P.tomentosa（Thunb.）Steud）叶为原料，采用超声波辅助提取法，通过单因素和正交试验研究乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数、提取温度以及超声波功率对熊果酸得率的影响，以期为毛泡桐叶熊果酸的开发利用提供基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 试材
　　泡桐（P.tomentosa（Thunb.）Steud）叶采摘于广西师范大学南苑，清洗干净，40 ℃烘干，粉碎过40目筛备用;熊果酸标准品（AR）购于广州分析测试中心科力技术开发公司;95%乙醇（AR）、无水乙醇（AR）、甲醇（色谱级）均购于西陇化工股份有限公司。
　　1.2 仪器
　　KQ-500VDE型双频数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）;2K-82（AB）型真空干燥箱（郑州长城科贸有限公司）;2F-2型三用紫外分析仪（上海市安亭电子仪器厂）;日本岛津系统高效液相色谱仪，包括CBM-20A控制器、LC-20双泵、SPD-20AC检测器。 　　1.3 试验方法
　　1.3.1 熊果酸含量的测定——HPLC法。
　　1.3.1.1 标准曲线的绘制。
　　（1）标准溶液的配制。准确称取熊果酸标准品5.0 mg，用甲醇定容至5 mL，制成熊果酸质量浓度为1 mg/mL的标准溶液，分别精密吸取该溶液0.10、0.20、0.40、0.50、0.75 mL加甲醇定容至10 mL，配制成0.010、0.020、0.040、0.050、0.075 mg/mL的标准溶液[21] 。
　　（2）色谱条件。色谱柱为Waters SunFireTM C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相为甲醇-磷酸水溶液（88∶12，V/V，pH=3），檢测波长210 nm;流速0.8 mL/min;柱温30 ℃;进样量20 μL。此条件下，熊果酸与其他成分分离度较好（R>1.2），理论塔板数不低于7 000。
　　（3）标准曲线的绘制。以峰面积积分值为纵坐标（Y）、熊果酸标准品浓度（X，mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得到熊果酸峰面积与熊果酸浓度的关系为：Y=1.123×107X-3.39×104。
　　1.3.1.2 供试样品溶液的制备。
　　精确称取经提取分离并干燥的熊果酸粗品5.0 mg，用甲醇定容至100 mL，配制成0.05 mg/mL的粗品溶液，经0.22 μm的微孔滤膜过滤，取滤液为供试液。
　　1.3.1.3 熊果酸得率的计算。其公式如下：
　　熊果酸得率=（提取液中熊果酸的质量/泡桐叶粉末的质量）×100%（1）
　　1.3.2 超声波辅助提取最佳提取工艺的确定。
　　1.3.2.1 单因素试验。
　　泡桐叶粉末经水煮沸10 min以除去水溶性杂质后，抽滤，收集滤渣冷冻干燥备用。精确称取10.00 g的滤渣，采取超声波辅助提取，分别考察乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取次数（C）、提取时间（D）、超声波功率（E）、 提取温度（F）对熊果酸得率的影响，将所得提取物进行初步纯化后测定其中熊果酸含量，方法同“1.3.1.1”。各因素水平的设置参考相关文献[10]，详见表1。
　　1.3.2.2 正交试验。
　　在单因素试验基础上固定对试验结果影响小的提取温度、提取时间和超声波功率，选择对试验结果影响大的乙醇浓度、料液比和提取次数3个因素，按L9（34）[22]进行正交试验，其因素水平设置详见表2。
　　1.3.2.3 验证试验。将正交试验极差分析所得的最优方案、正交表中结果最好的方案以及方差分析得出的方案进行验证试验，每个试验重复3次。
　　2 结果与分析
　　2.1 超声波辅助提取单因素试验
　　各因素对熊果酸得率的影响如图1所示，乙醇浓度、料液比和提取次数对熊果酸得率影响较明显，而提取时间、提取温度以及超声波功率对熊果酸得率的影响不明显，得率随因素变化的范围仅在0.1%左右。故正交试验中主要研究乙醇浓度、料液比和提取次数对熊果酸得率的影响。另外在乙醇浓度、料液比的整个区间范围内，熊果酸的得率随着参数值的增大一直呈上升趋势，故正交试验中需要提高这2个因素的上限值。而提取时间、提取温度、超声波功率以及提取次数对熊果酸得率的影响中，得率先上升后有所下降，当温度为65 ℃时，再提高温度熊果酸得率反而下降，所以选65 ℃为最佳提取温度;当提取时间超过40 min后，熊果酸得率开始下降，故选40 min为最佳提取时间;当超声波功率为350 W时，增加超声波功率熊果酸得率却下降，故选超声波最佳功率为350 W。
　　2.2 正交试验
　　固定提取温度65 ℃、提取时间40 min、超声波功率350 W，对乙醇浓度、料液比和提取次数进行正交试验，正交试验结果如表2所示。通过极差分析得出3个因素对熊果酸得率影响从大到小依次为提取次数、料液比、乙醇浓度，最优方案为A2B3C3。而方差分析显示，在给出的水平范围内，料液比和乙醇浓度对熊果酸得率的影响均不显著（FA<F0.10、FB<F0.10），故选最低水平即可;但提取次数对熊果酸得率有极显著的影响（FC> F0.05），选择最佳水平，所以确定熊果酸的最佳提取方案为A1B1C3。而正交表中结果最好的方案是A1B3C3。
　　2.3 验证结果
　　3组试验的验证试验结果如表3所示，A1B3C3、A1B1C3、A2B3C3试验方案所得熊果酸得率分别为0.740%、0.742%、0.749%，3种方案所得熊果酸得率差异都很小，故选择方差分析推测的方案A1B1C3，即熊果酸的最佳提取条件为乙醇浓度90%、料液比1∶20、提取次数3次、提取时间40 min、提取温度65 ℃、超声波功率350 W，在此条件下熊果酸的得率为0.742%。
　　3 小结
　　超声法提取相对于回流提取和索氏提取效率高、温度低，也比微波提取升温慢，利于保护物质活性，相对于超临界流体萃取法等[12-15]成本低、操作简单，故是一种比较适宜的大众化的提取熊果酸的方法。超声法提取中，在一定条件下，乙醇浓度、料液比和提取次数对熊果酸得率影响较大，超声功率、提取时间和提取温度对试验结果影响较小。故实际提取时，本着保护物质活性、节约成本和提高效率的基础上，主要考虑乙醇浓度、料液比和提取次数三因素。需要指出的是试验因素的主次顺序与选取的水平有关，如果因素水平选取发生改变，因素的主次顺序可能随着改变。在单因素试验中，各因素水平跨度相对较大，乙醇浓度、提取次数、料液比对试验结果影响明显;而在正交试验时，对乙醇浓度和料液比的水平范围缩小以期找出更准确的参数时，提取次数成为了影响相对最显著的因素。
　　该研究采用超声辅助法，通过单因素试验和正交试验分析了影响熊果酸得率的六大因素，并找出了毛泡桐叶超声提取熊果酸的最佳提取参数，为熊果酸的提取和泡桐资源的开发利用奠定了理论基础，但研究中并未考虑各因素间的交互作用，故若需要得到更详细和准确的试验数据则需要做更进一步的研究。 　　参考文献
　　[1] 中国科学院《中国植物志》编辑委员会.中国植物志：第67卷 第2分册[M].北京：科学出版社，1979：28-44.
　　[2] 于丽波，孙文洲，王晶，等.熊果酸联合顺铂抑制卵巢癌生长的实验研究[J].现代肿瘤医学，2009，17（8）：1410-1412.
　　[3] RAMOS A A，PEREIRAWILSON C，COLLINS A R.Protective effects of ursolic acid and luteolin against oxidative DNA damage include enhancement of DNA repair in Caco2 cells[J].Mutat Res，2010，692（1/2）：6-11.
　　[4] SAABY L，JGER A K，MOESBY L，et al.Isolation of immunomodulatory triterpene acids from a standardized rose hip powder（Rosa canina L.）[J].Phytother Res，2011，25（2）：195-201.
　　[5] ZHOU Y，LI J S，ZHANG X，et al.Ursolic acid inhibits early lesions of diabetic nephropathy[J].Int J Mol Med，2010，26（4）：565-570.
　　[6] 陶淵博，邢雅丽，方芝娟，等.生物活性物质熊果酸资源分布状况研究进展[J].林产化学与工业，2012，32（1）：119-126.
　　[7] 王杰，赵丽霞，雷建都，等.响应面法优化枇杷叶中熊果酸提取工艺及纯化的研究[J].热带作物学报，2015，36（8）：1518-1524.
　　[8] GOPAL V，MANDAL V，MANDAL S C.HPTLC evaluation of oleanolic acid and ursolic acid from the methanol extract of Wattakaka volubilis[J].Journal of acute disease，2014，3（1）：59-61.
　　[9] 张俊，李进，吕海英，等.扁桃果皮熊果酸提取工艺优化及体外抗氧化活性研究[J].食品与机械，2018，34（2）：154-158.
　　[10] 郭军，王丽丽，吴小说，等.西山焦枣中熊果酸超声法提取工艺研究[J].中国农学通报，2016，32（19）：175-181.
　　[11] 孟煜嘉，徐逸凡，王艳妮，等.微波及超声法提取苦丁茶中熊果酸的对比研究[J].机电信息，2017（17）：36-42.
　　[12] 王占一，金美花，王玉海，等.Plackett-Burman和Central Composite Design试验设计法优化石榴皮中熊果酸的SFE-CO2萃取工艺[J].中药材，2015，38（3）：610-614.
　　[13] 秦霞，刘红，任晓燕，等.应用亚临界水技术对枇杷叶中熊果酸的提取工艺优化研究[J].黑龙江工程学院学报，2016，30（6）：41-44.
　　[14] CAI C Y，WU S G，WANG C Y，et al.Deep eutectic solvents used as adjuvants for improving the salting-out extraction of ursolic acid from Cynomorium songaricum Rupr.in aqueous twophase system[J].Separation and purification technology，2019，209：112-118.
　　[15] 纵伟，赵光远，张文叶.常温超高压提取大花紫薇叶中2α-羟基熊果酸[J].林产化学与工业，2007，27（4）：111-114.
　　[16] 任秀莲，魏琦峰，周春山，等.沉淀吸附法提取苦丁茶中的熊果酸[J].中南大学学报（自然科学版），2004，35（4）：599-603.
　　[17] 杨俊红，段增宾，郭锦棠，等.微波预处理强化山楂回流提取的作用机理[J].天津大学学报，2006，39（7）：874-880.
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