超声-微波协同提取百香果皮果胶的工艺研究

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　　摘  要：以果胶得率为分析指标，采用超声微波协同提取百香果干果皮果胶，利用响应面分析法优化其工艺条件。结果表明，百香果皮果胶超声微波协同提取的最佳工艺参数为：液料比30 mL/g，pH 2.0，温度50 ℃，水浴60 min，超声功率50 W、微波功率600 W、超声-微波时间8.0 min，在此条件下，果胶得率可达（12.14±0.06）%。超声-微波协同法的提取效果与单独水提、超声、微波法的相比，得率分别提高了47.33%、34.74%和23.50%，3种提取方法的酯化度均≥50%，其说明百香果皮果胶属于高甲氧基果胶。扫描电镜结果显示，百香果皮细胞壁在超声微波协同作用下破碎更为彻底，利于果胶溶出。
　　关键词：百香果皮;果胶;超声-微波协同提取;扫描电镜
　　中图分类号：S667.9      文献标识码：A
　　Abstract： The extracting rate of the pectin was used as the analytical index， and the ultrasonic-microwave synergistic extraction of dried fruit peel pectin from passion fruit was optimized by the response surface methodology. The optimum process parameters of the ultrasonic-microwave synergistic extraction of the peel of passion fruit were obtained， namely liquid to material ratio 30 mL/g， pH 2.0， temperature 50 ℃， water bath 60 min， ultrasonic power 50 W， microwave power 600 W， ultrasonic-microwave time 8.0 min. Under the condition， the yield of pectin could reach （12.14±0.06）%. Compared with water extraction， ultrasonic and microwave methods， the extraction rate of ultrasonic-microwave synergy method increased by 47.33%， 34.74% and 23.50%， respectively. The esterification degree of the four extraction methods was≥50%， indicating that the peel pectin of passion fruit was a high methoxyl onein. The results of scanning electron microscopy showed that the cell wall of the fruit peel was broken more thoroughly under the synergistic effect of ultrasound-microwave， which was beneficial to the dissolution of pectin.
　　Keywords： peel of Passiflora edulis; pectin; ultrasonic-microwave synergistic extraction; scanning electron microscopy
　　百香果（Passiflora edulis Sims.）又名西番蓮、鸡蛋果，为半木质藤本攀缘或多年生常绿草质植物，在我国台湾、海南、广东、福建等地种植历史较长，并产生了一定的商业规模。其富含果胶、多糖、黄酮类、生物碱类、多酚类、维生素A和C、膳食纤维以及矿物Ca、Mg、Fe、Zn、Se、K等160多种有益成份，具有生津止渴、护肤养颜、化痰止咳、防癌抗衰、安神抗焦虑、抗炎抑菌等多种医药保健功效，因而也被誉为“果中之王”[1-4]。
　　百香果种植业的迅速发展，但随之带来百香果鲜果价格下降和售卖难等问题，且百香果皮水分含量高，贮藏困难、易腐烂变质等问题也存在。此外，整个百香果鲜果中，果皮约占50%～55%。但现阶段国内加工企业对百香果的产品开发主要集中在果肉饮料加工，利用百香果皮所生产的制品受限于技术等原因，主要是初加工产品，如果脯、果酱及蜜饯类等食品，产品种类单一，生产总量少，加工水平较低，附加值也不高。
　　热水浸提法仍是目前提取植物果胶采用的常见方法之一，此法虽使用仪器少，操作简单，但得率低且耗时。微波和超声辅助萃取近年来作为一种新兴提取技术被广泛地用于植物果胶提取。微波是一种具有较强穿透力的非离子电磁辐射，通过相互摩擦撕裂产生高效电介质热和内热，从而快速传递能量，加快植物中有效成分的溶出及扩散，缩短提取时间[5-8]。超声提取利用其空化作用使水介质产生高强度的微射流和机械振动，形成高强度的剪切和冲击力从而使细胞壁穿透性增加，促进细胞内有效成分溶出[9-11]。将上述2种方法协同使用，可在短时间内充分利用微波高能效应与超声波空化效应，实现对细胞快速、高效的处理，加速有效成分的溶出，从而大大减少萃取时间、降低能耗、提高萃取效率[12-15]。目前，对百香果皮果胶提取主要采用单一水提或超声或微波辅助等方法，尚无超声微波协同提取的百香果皮果胶的研究报道。本研究采用超声微波双辅助协同提取百香果皮果胶，利用响应面法优化该工艺的提取条件，并与单一水提或超声或微波辅助提取效果进行比较，同时采用扫描电子显微镜初步分析了百香果皮在提取前后的微观结构变化，旨在为百香果皮的精深加工及综合开发利用提供依据，亦可为产业化提取百香果皮果胶提供参考。 　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  材料与试剂  百香果鲜果皮（紫红色）由龙岩道心农业发展有限公司提供，将百香果皮清洗，烘干，粉碎过80目筛后备用。咔唑（P）、D-（+）-半乳糖醛酸，Sigma公司;C2H5OH、H2SO4、HCl，均为国产分析纯。
　　1.1.2  仪器与设备  CW-2000超声-微波协同萃取/反应仪，上海新拓分析仪器科技有限公司;EYELA N-1300旋转蒸发仪，日本东京理化公司;MS204TS电子分析天平，梅特勒托利多仪器上海有限公司;JB-4定时双向电子恒温磁力搅拌器，江苏常州德杜精密仪器有限公司;ZD-2自动电位滴定仪，上海精密科学仪器有限公司;100～1000 μL移液器，德国Eppendorf;ST16R高速冷冻离心机，美国Thermo;UV-800双光束紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司;UB-7 pH计，美国丹佛;XWDJ-350涡轮式粉碎机，浙江新世纪粉碎设备有限公司;FDV超细微粉碎机，燕山正德;S-3400N扫描电子显微镜，日本Hitachi。
　　1.2  方法
　　1.2.1  半乳糖醛酸标准曲线的绘制  参考李梅等[16]和张英楠等[17]的方法略改：精确称取D-半乳糖醛酸标准品0.100 g，溶解于水中，定容至100 mL，混匀得1 mg/mL D-半乳糖醛酸原液。取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL分别注入10 mL容量瓶，定容得一组半乳糖醛酸标准溶液（质量浓度为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 μg/mL）。取10支50 mL比色管加入1 mL不同质量浓度的半乳搪醛酸标准溶液，再分别沿比色管壁加入6 mL浓H2SO4混匀，置于沸水浴中反应20 min，冰浴降至室温。最后加入质量浓度为0.15%咔唑-乙醇溶液0.5 mL，摇匀静放在暗处显色60 min，在528 nm处测定其吸光度，每组实验平行3次，0号管为参比。以半乳糖醛酸质量浓度（x）为横坐标，吸光值（y）为纵坐标，绘制出标准曲线。
　　1.2.2  百香果皮果胶的制备  （1）百香果皮果胶的提取。称取5.0 g百香果皮粉末，按设定的每组实验提取条件，加入一定体积的蒸馏水，柠檬酸调节pH，50 ℃水浴60 min后，按预设超声微波协同萃取/反应仪（超声功率50 W）处理条件进行提取，提取液真空抽滤，将滤渣相同条件重复操作2次，合并滤液真空浓缩后用4倍体积的95%乙醇过夜，滤饼（用乙醇反复洗涤2次）真空冷冻干燥，即得百香果皮果胶。
　　（2）百香果皮果胶的得率测定。称取获得的果胶样品蒸馏水复容后，精密移取一定体积稀释，稀释液按1.2.1标准曲线制备方法平行测定3次吸光度值，用下面公式计算百香果皮果胶得率：
　　式中，C为样品的半乳糖醛酸浓度（μg/mL）;Ⅴ为果胶总体积（mL）;N为稀释倍数;W 为百香果皮粉质量（g）。
　　（3）百香果皮果胶酯化度的测定。参考周小敏等[18]、梅新等[19]和Pinheiro等[20]的方法略改：称取0.500 g果胶粉末，加少量无水乙醇润湿后加50 mL蒸馏水，置于磁力恒温搅拌器上搅拌至溶解，加入酚酞1滴，NaOH（0.1 mol/L）滴定至刚变色并记录消耗体积（V1），继续加入10 mL NaOH（0.1 mol/L），混勻后室温静置2 h，再加入10 mL HCl（0.1 mol/L），最后用NaOH（0.1 mol/L）滴定至刚变色并记录消耗体积（V2）。每组重复3次。按以下公式计算果胶的酯化度。
　　式中，V1——NaOH初始消耗体积（mL）;V2—— NaOH终点消耗体积（mL）。
　　1.2.3  百香果皮果胶超声微波协同提取的条件优化  （1）百香果皮果胶超声微波协同提取单因素实验。称取5.00 g百香果皮粉末，50 ℃水浴60 min后，预设提取工艺参数中的常规量为液料比30 mL/g，pH 2.0，微波时间5.0 min，微波功率450 W，按1.3.2步骤操作，分别考察pH（0.5～3.0），液料比（10～60 mL/g），微波功率（200～ 700 W），微波时间（2.0～12.0 min）对百香果皮果胶得率的影响。
　　（2）响应面分析百香果皮果胶超声微波协同提取实验设计。在上述单因素实验基础上，以果胶得率为响应值，液料比（A），pH（B），微波功率（C），微波时间（D）为自变量，采用四因素三水平的Origin 8.6软件设计（见表1）。
　　1.2.4  不同提取方式的比较  （1）提取效果对比实验。采用本研究中的超声-微波协同法得到的优化参数，与水提法、超声法和微波法进行对比实验，比较不同方法的提取效果。
　　（2）百香果皮果胶提取后残渣SEM（扫描电镜）对比实验。将水提、超声、微波和超声-微波协同提取残渣真空干燥，此4种残渣粉末及百香果皮粉末（对照），于离子溅射仪中真空镀金，利用SEM进行微观结构分析。
　　1.3  数据处理
　　每组实验均重复进行3次，运用SAS 8.1、Origin 8.6和SPSS 20.0软件进行数据处理与统计分析，数据以平均值±标准差表示。
　　2  结果与分析
　　2.1  百香果皮果胶含量测定标准曲线
　　由标准半乳糖醛酸质量浓度（x）与对应的吸光度（y）的关系，获得半乳糖醛酸标准曲线的回归方程y=0.005x0.0052（R2=0.9989）（图1），在0～90 μg/mL范围内呈现良好的线性关系。 　　2.2  单因素实验的结果与分析
　　影响百香果皮果胶得率的单因素实验结果见图2，其中液料比的得率，随液料比的增加而增加。当液料比在30～50 mL/g时增幅无显著差异，之后却有所下降。可能是因为溶质的扩散和溶出主要受传质动力影响。当提取溶剂和溶质之间的浓度差达到30 mL/g左右时，液料体系已达到动态平衡，即果胶基本被充分提取。当液料比超过50 mL/g后，可能因随溶剂的增加会相应加大其对超声微波的能量消耗，导致溶质所吸收的能量下降，得率下降。综合考虑后续的浓缩操作和耗能成本等因素，料液比选择30 g/mL为宜。
　　百香果皮果胶的得率，随pH的增大先增加后下降，在pH 2.0左右时达最大值。这是由于在一定的酸度条件下，原果胶会分解成果胶，果胶会分解为甲醇和果胶酸，且果胶的溶出跟果皮组织结构的破坏力有关。当酸度较大时，果胶被分解，而超过pH 2.0后，随着酸度的降低对果皮组织破坏力相应减弱，果胶溶出也相应减少，故得率都较低。因此，选择pH 2.0最适宜。
　　随着微波功率的增加，百香果皮果胶得率呈现先上升后降低的趋势，这可能是因为当功率较小时微波的热效应较弱，导致原料内部的温度过低不利于果胶的溶出和扩散。当微波功率过大时可能会迅速增大体系压力使溶剂局部温度过高，造成百香果皮中一些其他杂质溶出，果胶溶出减少从而使得率下降。同时功率过高原料容易溢出，易引起实验误差。因此，微波功率选择600 W比较适宜。
　　百香果皮果胶的得率，随微波时间的延长先升高后下降，可能是因为处理时间过短时溶液的内部温度和压力值过小，使果皮中果胶溶出不够彻底，产率低。但微波处理时间过长会使果胶降解程度加大，导致得率下降。因此，微波时间宜选择8 min较为合理。
　　2.3  响应面优化百香果皮果胶提取工艺的结果与分析
　　2.3.1  优化百香果皮果胶提取工艺的设计与结果    根据上述百香果皮果胶提取的单因素实验结果，以百香果皮果胶得率为分析指标，利用Origin 8.6软件进行方案设计与分析，获得结果见表2。
　　对表2中的各因素和指标的实验数据进行回归拟合，可得各因素变量与百香果皮果胶得率（R）间的二次响应面回归模型。
　　2.3.2  响应面优化百香果皮果胶提取实验的方差分析结果  为进一步阐明各因素对百香果皮果胶得率的影响程度和二次响应面回归模型的有效性，对上述二次响应面模型进方差分析，其结果见表3。
　　从表3可以看出，A（液料比）、B（pH）、C（微波功率）、D（微波时间）对百香果皮果胶得率的贡献率为：B>C>D>A。对百香果皮果胶得率影响中除了A、CD不显著（P>0.05）及C、D、AC和BC影响显著（P<0.05）外，其余的均达到极显著水平（P<0.01）。此吸附模型极显著（P< 0.0001），失拟项P =0.5703>0.05不显著，表明实验设计误差小，该实验模型比较理想;模型的决定系数R2=0.9907，且校正决定系数Adj.R2= 0.9814，变异系数CV=0.80%，可看出实验结果可靠回归方程拟合程度良好，能较精准预测和分析液料比、pH、微波功率和微波时间对果胶得率的影响。
　　表3  百香果皮果膠得率模型回归方差分析
　　Tab. 3  Analysis of variance for the fitted regression equation for tthe extraction yield of pectin from peel of P. edulis
　　方差来源
　　Variance source     平方和
　　Sum of squares      自由度
　　DF   均方
　　Mean square   F值
　　F value    Prob>F   显著性
　　Significant
　　模型       9.87 14    0.71 106.53   <0.0001  **
　　A     0.015      1     0.015      2.22       0.1584
　　B     0.075      1     0.075     11.36      0.0046    **
　　C     0.051      1     0.051      7.66 0.0151    * 　　D     0.049     1     0.049     7.46       0.0162    *
　　AB  0.10       1     0.10       15.47      0.0015    **
　　AC  0.040      1     0.040      6.04       0.0276    *
　　AD  0.12       1     0.12       18.50     0.0007    **
　　BC   0.036     1     0.036     5.45       0.0349    *
　　BD  2.15 1     2.15 324.16   <0.0001  **
　　CD  0.014     1     0.014      2.17       0.1624
　　A2   3.44 1     3.442      519.11   <0.0001  **
　　B2   2.29 1     2.29 345.87   <0.0001  **
　　C2   1.17       1     1.17       177.31    <0.0001  **
　　D2   3.96       1     3.96       598.60   <0.0001  **
　　殘差       0.093      14    6.621E-003         
　　失拟项    0.065     10    6.529E-003    0.95       0.5703    不显著
　　纯误差    0.027     4     6.850E-003         
　　总和       9.97       28                
　　注：**表示差异极显著（P<0.01）;*表示差异显著（P<0.05）。
　　Note： ** indicates extremely significant difference （P<0.01）; and * indicates significant difference （P<0.05）.
　　2.3.3  各因素对百香果皮果胶得率的交互作用的结果与分析  从图3描绘的各因素三维响应面图和等高线图中可直观看出，液料比对百香果皮果胶得率影响最小，pH的影响最大，微波功率和时间影响其次。具体体现在其对应的曲面倾斜度越来越陡峭和等值线的形状越来越密集。利用软件预测获得最佳条件为：液料比29.91 mL/g，pH 2.03，微波功率608.30 W，微波时间8.01 min，得率最大理论值为12.20%。考虑实际操作可行性，以上条件修正为液料比30 mL/g、pH 2.0、微波功率600 W、微波时间8.0 min。 　　2.3.4  优化条件下百香果皮果胶得率的验证实验  按上述优化后的条件（超声功率50 W、液料比30 mL/g、pH 2.0、微波功率600 W、超声-微波时间8.0 min）进行3次平行实验，果胶得率为：
　　（12.14±0.06）%、（12.15±0.13）%、（12.07±0.07）%、（12.20±0.04）%，RSD=0.59%，实际值与其预测值相对误差为0.54%。因此，该回归方程模型优化得到的百香果皮果胶提取工艺参数组合准确度高，可有效、可靠地指导实际操作。
　　2.4  不同提取方法的比较结果与分析
　　2.4.1  提取效果的实验结果与分析  由表4可以得出，超声-微波协同提取与单一的水提、超声和微波提取相比得率分别提高了47.33%、34.74%和23.50%，且具有提取时间短、节能等优点。分析其原因，可能是相比单一的水提、超声和微波提取，超声-微波协同提取可在短时间内协同利用适宜的微波热效应和超声波的空化作用，加快对百香果皮细胞结构地破坏，更有利于果胶的释放，进而大幅度提高果胶得率[15]。4种方法提取的果胶酯化度均≥50%，故百香果皮果胶属于高甲氧基果胶。其中超声-微波协同法提取的百香果皮果胶酯化度最高，其次是超声波和微波提取的，水浴提取的酯化度较低。这可能因为水浴提取对果胶结构的破坏程度最小，可使甲氧基和乙酰基得以更多地保留。而超声波和微波在提取过程中产生了强烈的空化和化学效应，对直链和支链的结构造成更大破坏，果胶链上羧基大部分被取代，导致酯化度上升。
　　2.4.2  扫描电镜的观察结果与分析  不同方法提取前后百香果皮渣的微观结构由扫描电镜观察结果如图4所示，可以看出与未经过处理的对照组（1）相比，采用水浴处理后百香果皮渣的组织结构由紧密变得松散，超声处理后结构更加膨胀、均匀，微波提取后体积明显增大、结构也更蓬松，而超声微波协同后则使结构破坏最严重，变得更加细碎、膨大、疏松。这是可能由于超声波的机械振动及撞击作用产生了强烈的冲击波，使百香果皮的组织破裂;微波能在短时间高效加热升温，使细胞内部急剧升温，结构变得膨大;而超声微波协同可同时接受超声波的空化效应与微波特有的机械和热效应，更彻底地破坏了百香果皮渣的表面结构，组织结构形成细碎、膨胀、松散，导致有效成分充分快速溶出，从而提高百香果皮果胶的得率[12]。由此可见，百香果皮果胶的得率可能与百香果皮结构破坏程度存在一定的相关性。
　　A：对照;B：水浴处理后;C：超声处理后;D：微波处理后;E：超声微波处理后。
　　A： CK; B： Treated by water; C： Treated by ultrasound; D： Treated by microwave; E： Treated by ultrasonic-microwave method.
　　图4  百香果皮渣扫描电镜图（1.00 k）
　　Fig. 4  Scanning electron microscope images of residual of peel of P. edulis （1.00 k）
　　3  讨论
　　目前对于百香果皮果胶的提取方法较多，主要以常见的水提和酸提醇沉为主，为加快细胞壁的破裂在此基础上出现超声波、微波、高压及酶法辅助等提取方法，每种方法因品种、操作方法的不同各有优势，得率也有所差异。本研究采用超声微波辅助响应面法优化出百香果皮果胶最佳提取条件：pH 2.0，30 mL/g液料比在50 ℃温度下先水浴60 min，再置于超声微波协同萃取/反应仪（超声功率50 W、微波功率600 W）處理8.0 min，此时得率为（12.14±0.06）%，酯化度为（66.46±0.41）%。张凤仙等[21]采用酸提醇沉（0.75%柠檬酸，90～95 ℃，2 h，固液比l∶4），得率为8.57%，甲氧基含量为9.8%（甲氧基含量≥7%为高酯果胶）。陈颖珊等[22]采用混合酸法（30%柠檬酸∶盐酸= 2∶1，料液比45∶1，pH 1.5，65.5 ℃，1 h），得率为10.98%，酯化度为63.77%。与张凤仙等[21]和陈颖珊等[22]相比，本研究的得率分别提高41.66%和10.57%。黄永春等[23-24]采用传统酸提，得率为2.22%，甲氧基含量为10.28%，采用超声波和微波辅助提取，得率分别为2.51%和2.60%，甲氧基含量为10.47%和10.39%。刘运花等[25]以复合酶法提取西番莲果胶，得率为2.63%。与黄永春等[23-24]和刘运花等[25]的研究相比，本研究的得率分别提高了4～6倍。原因可能是采用超声微波协同提取可在短时间内利用微波对百香果皮细胞结构的破坏力和微波的热效应以及超声波的机械和空化效应，增加细胞壁和细胞膜的通透性，增大介质的穿透力及分子的运动速度[13]，更有利于果胶充分且迅速溶出，进而大幅度提高了得率。此外，本研究采用原料预先浸泡（50 ℃，60 min），可利用水的作用将百香果皮细胞溶胀，降低果胶扩散到水中的阻力，亦有利于果胶的溶出[26]。进一步比较后可发现，黄永春等[23-24]和刘运花等[25]所用原料均为百香果鲜果皮，由于百香果鲜果皮中水分含量高达88%左右。由此可知同等质量条件下，百香果鲜体中果胶含量明显低于干体的，从而造成得率差异极显著。综上，可知百香果品种、原料含水量、提取方法和提取条件等因素对香果皮果胶得率有极显著影响，但都属于高甲氧基果胶。
　　4  结论
　　本研究在单因素实验的基础上，以百香果皮果胶的得率为响应值，对百香果皮果胶的提取参数进行响应面优化实验，最终确定超声微波辅助法的最佳工艺参数：液料比30 mL/g，pH 2.0，温度50 ℃，水浴60 min，超声功率50 W、微波功率600 W、超声微波时间8.0 min，百香果皮果胶得率为（12.14±0.06）%，与相同参数条件下单一的水提、超声及微波法提取相比，得率分别提高了47.33%、34.74%和23.50%，其酯化度在61.62%～66.46%之间，均为高酯化果胶。扫描电镜结果显示超声微波协同法使百香果皮的结构变得更加细碎、多孔、疏松，更有利于果胶的溶出。同时超声微波协同提取法操作简便，结果可靠，稳定性好，而且具有高效、快速、节能、无污染等特性，可作为百香果皮果胶提取工艺进行推广应用。 　　参考文献
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