三叶青多糖提取工艺优化及单糖组成分析

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　　摘   要   为优化三叶青多糖的提取工艺，并分析其单糖组成，通过正交试验设计方法优选三叶青多糖的最佳提取工艺，同时，采用柱前衍生化-高效液相色谱法来测定单糖组成。结果表明：三叶青多糖的最佳提取工艺为料液体积比1∶25，提取2次，每次2.5 h，醇沉浓度70%。该方法对多糖提取率为7.40%;柱前衍生化-高效液相色谱法分析得三叶青多糖主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、岩藻糖、半乳糖、阿拉伯糖等单糖组成。本实验方法简单可行。
　　关键词   三叶青多糖;提取工艺;单糖;柱前衍生化
　　中图分类号：Q599    文献标志码：A    DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.1.002
　　葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg），别名三叶青、金丝吊葫芦、丝线吊金钟、三叶扁藤等，分布于浙江、福建、江西等地[1-2]，是新“浙八味”之一[3]。三叶青性凉、无毒、味甘微苦，有清热解毒、活血止痛、祛风、化痰等功效[4]，常用于治疗高热惊厥、肺炎、肝炎、风湿、咽痛、瘰疬、痈疔疮疖等[5-6]。三叶青的化学成分有黄酮类、萜类、多糖类、酚类、氨基酸、甾体类、油脂类等[7]。目前，关于三叶青多糖的研究较少[8]，本文旨在对三叶青多糖提取工艺优化及其单糖组成进行分析，为三叶青多糖的研究和开发利用提供一定的实验基础及理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　AE240电子天平（瑞士METTLER公司），HH-S数控恒水浴锅（金华市文华科教实验仪器厂），低温旋转蒸发一体机（日本YAMATO公司），SHIMADZU UV-2450 紫外分光光度仪（日本SHIMADZU公司），VD115真空干燥器（德国BINDER公司），515型HPLC系统（美国Waters公司），LC 20vp HPLC系统（日本SHIMADZU公司）。
　　三叶青药材（杭州华东中药饮片有限公司，批号：151119、151212、151220）;无水葡萄糖标准对照品（KAYON公司，批号：20111203）;甘露糖（Man）、鼠李糖（Rham）、半乳糖醛酸（GalUA）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、氨基葡萄糖（GlcN）、氨基半乳糖（GalN）、葡萄糖（Glc）、阿拉伯糖（Ara）、岩藻糖（Fuc）和半乳糖（Gal），共10种单糖标准品（Sigma-Aldrich 公司）;乙腈（色谱纯，德国MERCK公司）;其他试剂均为国产分析纯。
　　1.2 方法
　　1.2.1 三叶青多糖含量测定
　　1.2.1.1供试品溶液的制备
　　取三叶青药材饮片适量，打粉，过三号筛，精密称取100 g粉末，加30倍蒸馏水，回流提取3次，每次1 h，收集3次滤液并合并，浓缩至2 L，然后用Sevage法（样品溶液、二氯甲烷、正丁醇的体积比为25∶4∶1）脱蛋白，加无水乙醇，醇沉过夜，干燥沉淀物，得三叶青粗多糖，粗多糖加水溶解，定容至1 L，得供试品溶液。
　　1.2.1.2对照品溶液的制备
　　精密称取105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖适量，精密称定，加水制成0.246 mg·mL-1的对照品溶液。
　　1.2.1.3检测波长的选择
　　精密吸取供试品溶液 1 mL、对照品溶液0.5 mL，置于具塞比色管中，加蒸馏水至2 mL，精密加入1 mL的5%苯酚溶液，摇匀，准确移取浓H2SO4 5 mL，迅速摇匀后，放置5 min，置沸水浴中加热30 min，取出，放入冰水浴中冷却20 min，在400～600 nm范围对其进行扫描，选择最大吸收波长作为检测波长[9]。
　　1.2.1.4标准曲线的绘制
　　精密吸取葡萄糖标准液250、500、750、1 000、1 250、1 500 ?L于具塞试管中，分别加蒸馏水定容至2 mL，得系列对照品溶液，精密加入1 mL 5%苯酚溶液及5 mL的浓H2SO4溶液，80 ℃水浴提取，取出后放入冰水浴中，冷却20 min，以蒸馏水作为空白，用分光光度计在490 nm处测定吸光度，以浓度为横坐标（C），吸光度为纵坐标（A），绘制标准曲线。
　　1.2.1.5含量测定
　　精密吸取2 mL供试品溶液，按“1.2.1.4”项下操作测定吸光度，计算三叶青多糖含量[10]。
　　1.2.2 方法学考察
　　1.2.2.1精密度實验
　　精密吸取供试品溶液2 mL，按“1.2.1.4”项下操作测定吸光度，连续测定5次，计算RSD值。
　　1.2.2.2稳定性试验
　　精密吸取2 mL供试品溶液，按“1.2.1.4”项下操作，分别在30、60、90、120、150、180 min测定吸光度。计算RSD值。
　　1.2.2.3重复性试验
　　精密称取6份干燥后的三叶青样品，分别提取，每份供试品溶液取2 mL，置于试管中，按“1.2.1.4”项下操作，依法测定吸光度，计算RSD值[11]。
　　1.2.2.4加样回收试验
　　精密吸取已知浓度的同一供试品溶液1 mL，共9份，分别加入适量多糖标准品溶液1 mL，按“1.2.1.4”项下操作，依法测定吸光度，计算其平均加样回收率和RSD值[12]。
　　1.2.3 三叶青多糖提取工艺优化（单因素试验）
　　1.2.3.1提取时间
　　固定提取温度100 ℃，料液比（均为体积比，下同）1∶30，醇沉浓度90%，改变提取时间（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h），提取2次，提取三叶青多糖，计算三叶青多糖的提取率。 　　1.2.3.2提取次数
　　固定提取温度100 ℃，提取时间为2 h，料液比1∶30，醇沉浓度90%，改变提取次数（1次、2次、3次、4次、5次）提取三叶青多糖，计算三叶青多糖的提取率。
　　1.2.3.3料液比
　　固定提取温度100 ℃、提取时间为2 h，提取次数2次，醇沉浓度90%，改变料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）提取三叶青多糖，计算三叶青多糖的提取率。
　　1.2.3.4醇沉浓度
　　固定提取温度100 ℃、提取时间为2 h，提取次数2次，料液比1∶30，改变醇沉浓度（60%、70%、80%、90%、95%）提取三叶青多糖，计算三叶青多糖的提取率。
　　1.2.4 三叶青多糖提取条件优化
　　在单因素试验基础上，以提取时间（A）、提取次数（B）、料液比（C）和醇沉浓度（D）为考察因素，设计L9（34）正交试验。
　　1.2.5 三叶青多糖的单糖组成测定
　　1.2.5.1混合单糖对照品的衍生化[13-14]
　　分别精密称取各单糖对照品4 mg置10 mL量瓶中，加水溶解混匀，定容得0.4 mg·mL-1混合单糖对照品储备液。精密量取稀释后的混合单糖对照品溶液100 μL，于具塞试管中，依次加入0.5 mol ·L-1 PMP甲醇溶液100 μL和 0.3 mol ·L-1的NaOH溶液100 μL，混匀，70 ℃水浴反应30 min，取出冷却至室温，加入0.3 mol ·L-1的HCl 100 μL进行中和，再加入1 mL氯仿萃取，充分震荡，弃氯仿层，重复3次，取上清液定容至1 mL，0.45 μm微孔滤膜滤过，10 μL进样分析。
　　1.2.5.2供试品的衍生化[15]
　　精密称取三叶青多糖4 mg置于2 mL量瓶中，溶解并定容。精密吸取100 μL置于安瓿瓶中，加入1 mol ·L-1 TFA 2 mL，100 ℃水解8 h，冷却至室温，以1 mol ·L-1 NaOH溶液调pH值为7，以纯化水稀释并定容至5 mL，过滤，取续滤液，按“1.2.5.1”项下的方法进行衍生化处理。
　　1.2.5.3色谱条件
　　色谱柱ZORBAX SB-C18 （250 mm ×4.6 mm，5 μm）;流动相0.02 mol/L乙酸铵-乙腈（84∶16） ;流速0.5 mL·min-1;柱温30 ℃;檢测波长245 nm;进样量10 μL。
　　2 结果与分析
　　2.1 三叶青多糖含量测定
　　2.1.1 检测波长的选择
　　供试品溶液与对照品溶液均在490 nm处有最大吸收，故选择检测波长为490 nm。
　　2.1.2 标准曲线
　　以浓度为横坐标（C），吸光度为纵坐标（A），绘制标准曲线。得回归方程：y=9.268 3x+0.001 3，r=0.999 3。结果表明，葡萄糖对照品在0.020 5～0.123 mg·mL-1浓度范围内呈较好的线性关系。
　　2.2 方法学考察
　　精密度实验测定结果得吸光度均值为0.385，RSD=0.50%。表明该方法精密度良好，符合含量测定要求。稳定性试验测定结果得RSD=0.49%，表明在显色后180 min内稳定性良好。重复性试验测定结果得RSD=0.85%，表明重复性良好。加样回收试验平均回收率为99.8%，RSD=2.97%，表明方法的准确性良好，方法可行。结果列于表1。
　　2.3 三叶青多糖提取工艺优化
　　2.3.1 单因素试验
　　提取时间2 h时，多糖的提取率达到最高;提取次数为3次时，多糖的提取率达到最高;料液比为1∶20时，多糖的提取率达到最高;醇沉浓度为80%时，多糖的提取率达到最高。
　　2.3.2 提取条件优化
　　在单因素试验基础上，设计L9（34）正交试验（见表2），试验结果见表3，方差分析结果为差异均不显著。由结果可知，各因素影响大小依次为：料液比>提取时间>提取次数>醇沉浓度;三叶青多糖的最佳提取工艺为A3B1C3D1，即提取时间为2.5 h，提取次数为2次，料液体积比为1∶25，醇沉浓度为70%。
　　采用最佳提取工艺条件进行验证试验，得多糖提取率为7.40%。
　　2.4 三叶青多糖的单糖组成
　　单糖标准品溶液色谱图见图1，三叶青多糖水解液单糖色谱图见图2。分析结果显示，三叶青多糖由甘露糖（Man）、鼠李糖（Rham）、半乳糖醛酸（GalUA）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、氨基葡萄糖（GlcN）、氨基半乳糖（GalN）、葡萄糖（Glc）、阿拉伯糖（Ara）、岩藻糖（Fuc）、半乳糖（Gal）组成。
　　3 小结与讨论
　　多糖的提取大多用水浴提取法，包括酸提取法、碱提取法[16]，此外还有超声波提取法[17]，微波提取法[18]、酶解法等[19]。水浴提取法是多糖提取的最常用方法，该方法反应条件温和，对多糖的结构组成及生理活性破坏较小。本实验采用水提醇沉法提取三叶青多糖，并通过正交试验优选出最佳提取工艺。饶君凤等采用离子色谱法测定三叶青块根和叶中多糖的单糖组成，测得有岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6种单糖[20]。本实验通过柱前衍生化HPLC法对三叶青多糖的单糖组成加以分析，结果表明，除了上述6种单糖外还有半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖这4种单糖，对文献报道进行了补充。
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　　（责任编辑：丁志祥）
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