昭通天麻多糖含量测定及超声辅助提取条件优化

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　　摘  要：采用苯酚—硫酸法对昭通天麻多糖含量测定，结果显示：在490nm波长处测定吸光度，在浓度0～0.0175mg/mL线性关系良好，建立回归方程y=79.186x+0.0005（r=0.9990）;经精密度、稳定性、加标回收率以及重现性等实验证明，该方法可用于天麻多糖含量的测定。通过正交实验研究昭通天麻多糖的超声提取条件，并采用苯酚—硫酸法对多糖含量进行测定，超声辅助提取的最佳提取条件组合为：提取温度45℃，提取时间55min，料液比1∶35（g/mL）。
　　关键词：天麻;多糖;苯酚—硫酸法
　　中圖分类号 S567.39 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）（02-03）-0028-03
　　Abstract：Phenol-sulfuric acid method was used to determine the content of polysaccharides in Gastrodia elata.The results showed that the absorbance at 490nm wavelength had a good linear relationship between the concentration of 0～0.0175mg/mL.The regression equation was established（y=79.186x+0.0005，r=0.9990）.The results of precision，stability，recovery rate and reproducibility experiments showed that the method could be used determination of polysaccharide content in Gastrodia elata.The extraction conditions of Polysaccharides from Gastrodia elata in Zhaotong were studied by orthogonal experiment.The content of polysaccharides was determined by phenol-sulfuric acid method.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows：extraction temperature 45℃，extraction time 55 min，solid-liquid ratio 1：35 （g/mL）.
　　Key words：Gastrodia elata;Polysaccharide;Phenol-sulfuric acid method
　　天麻（Gastrodia elata Blume）属兰科多年生共生草本植物，为名贵的传统中药，至今已有近3000年的临床应用历史。天麻含有天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、香草醛、香草醇、派立辛、天麻多糖、多种氨基酸等有效成分，现代研究表明天麻具有镇静、催眠，抗惊厥，提高机体免疫力，改善记忆力等药理作用[1]。近年来，随着分子生物学技术的发展，多糖被认为是一类重要的信息分子。天麻多糖还具有抗氧化[2，3]、延缓细胞衰老[4]、减轻视网膜损伤、保护视网膜[5]、降血压[6]、保肝[7，8]、抗肿瘤[9]等方面作用，因其毒副作用小、安全性强、功能多等特点而被越来越多的人所关注。
　　昭通是天麻主要产区之一，自然条件得天独厚，所产天麻质量上乘，享誉国内外。笔者采用苯酚-硫酸法测定昭通天麻多糖的含量，通过正交实验筛选天麻多糖的最佳提取条件，为昭通天麻的进一步开发利用提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料与试剂 供试鲜天麻从昭通小草坝天麻种植田间采集。苯酚（国药沪试），无水葡萄糖，无水乙醇，浓硫酸（南京化学试剂有限公司），以上试剂均为分析纯;实验用水为去离子水。
　　1.2 实验仪器 UV759型紫外-可见光分光光度计（上海奥普勒仪器有限公司）;AX224ZH型电子天平（常州奥豪斯仪器有限公司）;0412-1型离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）;HWS-28型数显恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）;SK5200LHC 超声波洗涤器（上海科导超声仪器有限公司）。
　　1.3 实验方法
　　1.3.1 天麻预处理 鲜天麻采样后立即回实验室洗净，蒸透，切片后55℃烘干，粉碎后过60目筛。取过筛的天麻干粉5g，按料液比1∶30加入80%乙醇，超声浸提，除去天麻中的单糖、低聚糖、脂类、色素等成分，过滤后晾干、粉碎成天麻粉末备用。
　　1.3.2 标准曲线的绘制 精确称取烘干至衡重的葡萄糖0.01g，加去离子水溶解后定容至100mL，配制成浓度为0.1mg/mL的对照品溶液待用。称取5g苯酚加水定容至100mL，配制成浓度为5%的苯酚溶液待用。取8支具塞试管，分别准确量取葡萄糖对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL至试管，并加水至溶液体积为2.0mL。在试管内分别加入1mL5%的苯酚溶液和5mL的浓硫酸，静置10min后，放入沸水中水浴反应15min，取出冷却至室温。以加葡萄糖对照品溶液0.0mL的空白溶液作参比，在波长490nm处测量吸光度值，建立标准曲线。
　　1.3.3 天麻含量的测定方法 参照王韬[10]的方法并进行了修改。精确称取1g预处理过的天麻粉样品至锥形瓶中，按料液比1∶25加去离子水，35℃超声提取20min，将溶液定容至100mL后过滤，取滤液10mL定容至100mL作为供试样品溶液，参照1.3.2的方法测吸光度值，并按式（1）计算天麻多糖含量。 　　1.3.4 正交实验设计 采用超声辅助提取工艺提取昭通天麻多糖，为综合考虑各因素对天麻多糖含量的影响，选取提取温度、提取时间、料液比3个考查因素，设计3因素3水平正交实验（见表1）。
　　2 结果与分析
　　2.1 绘制标准曲线 不同体积的对照品溶液在490nm处测得的吸光度值见表2，以葡萄糖对照品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程：y=79.186x+0.0005（r=0.9990），表明该方程可用于昭通天麻多糖的含量测定。
　　2.2 精密度实验 取0.5mL天麻多糖供试样品溶液，按1.3.2的方法连续测定5次，测得天麻多糖溶液在490nm处吸光度值见表3，结果RSD=2.56%（n=5），表明精密度良好。
　　2.3 稳定性实验 取天麻多糖供试样品溶液0.5mL，按照1.3.2的方法，每隔0.5h测1次吸光度值，结果见表4，表明反应2.5h内溶液显色稳定。
　　2.4 加标回收率实验 取5支具塞试管，分别加入0.5mL天麻多糖供试溶液和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL对照品溶液，补水至2mL，参照1.3.2的方法计算回收率。结果见表5。由表5可知，平均加样回收率为100.50%，RSD为1.78%，表明本方法准确度较好，能测定天麻多糖的含量。
　　2.5 重现性实验的测定 为考察测定方法的可靠性特设计重现性实驗，称取同一批次的天麻粉参照1.3.2和1.3.3的方法进行处理，结果见表6，结果RSD=2.96%，表明该方法重现性良好。
　　2.6 天麻多糖超声提取条件的优化 由表7可知，在超声辅助提取天麻多糖的过程中，提取温度对天麻多糖的提取率影响最大（R=12.46），其次为料液比，提取时间的影响最小。最优提取工艺为：提取温度45℃，提取时间55min，料液比1∶35（g/mL）。
　　3 结论与讨论
　　苯酚-硫酸法测定天麻多糖含量结果稳定、重现性强、操作方便，用于天麻多糖含量测定较为适合。在490nm波长处测定吸光度的回归方程为y=79.186x+0.0005（r=0.9990）。正交实验结果显示，超声辅助提取的最佳提取条件组合为：提取温度45℃，提取时间55min，料液比1∶35（g/mL）。
　　目前天麻在全国多个地区广泛种植，研究资料表明各地天麻的多糖差异较大，德江天麻多糖提取率最高达39.93%[11]，西藏天麻多糖提取率最高达33%[12]，陕西天麻多糖提取率最高达32.98%[13]，而本实验研究结果显示昭通天麻多糖提取率最高达42.29%。不同提取方法和测定方法对天麻多糖含量结果也有差异[10，14，15]，因此有必要建立统一的多糖检测方法和完善的质量评价体系。同时天麻多糖含量高低与天麻品质之间的内在联系也有待进一步研究。
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　　（责编：徐世红）
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