降香黄檀叶枯病菌的鉴定及其生物学特性

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　　摘  要：近年来，降香黄檀叶枯病的危害越来越严重，为深入了解该病菌特征，本研究对该病原菌进行鉴定，以期为制定更有效的防治措施提供依据。本研究对降香黄檀叶枯病病株进行病原菌分离，并对病原菌进行了形态学观察及rDNA-ITS序列测定，确定该病原菌为天门冬拟茎点霉菌[Phomopsis asparagi （Sacc.） Bubak]。通过观察该病原菌在不同培养基、温度、pH、光照等4种环境因素中的生长情况，发现该病原菌在马铃薯果糖琼脂培养基（PFA）中菌丝生长最快;菌丝在10～30 ℃均能生长，最适宜的生长温度为25～30 ℃;最适宜的pH为6;光照对该病原菌的生长没有显著影响。
　　关键词：降香黄檀;叶枯病;天门冬拟茎点霉;鉴定;生物学特性
　　中图分类号：S763.15      文献标识码：A
　　Identification and Biological Characteristics of Dalbergia odorifera Leaf Blight
　　CHEN Yao， LI Hangyu， ZHOU Deming*
　　Central South University of Forestry and Technology / Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration on Control of Artificial Forest Diseases and Pests in South China / Hunan Provincial Key Laboratory for Control of Forest Diseases and Pests / Key Laboratory for Non-wood Forest Cultivation and Conservation of Ministry of Education， Changsha， Hunan 410000， China
　　Abstract： In recent years， the harmfulness of Dalbergia odorifera leaf blight has become more and more serious. In order to provide a basis for the control and comprehensive treatment of this disease， the pathogenic fungus causing the disease was isolated and identified and the biological characteristics were studied. In this study， the pathogenic fungus was isolated from the pathogen of D. odorifera leaf blight， and the morphological observation of the pathogenic fungi was carried out. And the rDNA-ITS sequence was obtained by sequencing. The pathogenic fungus was identified as Phomopsis asparagi. Through experiments on the growth medium， temperature， pH value and illumination of the pathogens， the mycelial growth of the fungus in PFA medium was the fastest. The mycelium could grow at 10–30 ℃， and the optimum temperature for mycelium growth was 2530 ℃. The optimum pH for the mycelium growth was 6. Light had no significant effect on the growth of the pathogen.
　　Keywords： Dalbergia odorifera; leaf blight; Phomopsis asparagi; identification; biological characteristics
　　DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.05.022
　　降香黃檀（Dalbergia odorifera），俗称海南黄花梨，作为国家二级保护植物，是我国四大名木之一，其心材结构致密，坚硬极重，耐湿耐腐，纹理细密，有芳香气味，是制造名贵家具、乐器、雕刻、工艺品的上等材料[1-2]。降香黄檀一般生长在热带地区，为我国海南省特有树种。
　　目前，国内外有关降香黄檀病虫害的研究相对较少，大多数集中在降香黄檀生物学特性、引种育苗、造林栽培、药理药性等方面。伍慧雄等[3]在对广东肇庆市国有林业总场属下的3个林场和2个苗圃基地调查时发现，降香黄檀的主要病害为炭疽病和细菌性穿孔病，主要虫害为螟蛾类蛀梢害虫。桑利伟等[4]对降香黄檀炭疽病的病原菌进行研究，鉴定出降香黄檀炭疽病病原菌为胶孢炭疽菌[Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Sacc.]。刘洪湾等[5]、董文统等[6]对广东省、海南省降香黄檀主要病虫害进行了全面调查，研究表明降香黄檀主要病虫害有黑痣病、幼苗枯萎病、细菌性穿孔病、炭疽病、叶枯病、卷叶虫、瘤胸天牛、金龟子、白蛾蜡蝉、局部黑斑等。降香黄檀的黑痣病和炭疽病导致病株叶片逐渐干枯或穿孔甚至脱落，影响了植物的生长与发育，对其成材也有较大影响[5-7]。目前，国内外关于降香黄檀叶枯病害系统性的研究尚未见报道。为了进一步了解降香黄檀叶枯病，本研究开展该病原菌的鉴定与生物学特性研究，从而为降香黄檀叶枯病的防治与综合治理提供科学依据。 　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　病害样本采自海南科大林业有限公司基地，样本为新鲜的叶枯病带叶病枝和健康的带叶枝条。
　　1.2  病原菌分离与纯化
　　使用无菌不锈钢手术刀在超净工作台上切取叶片病斑的病健康交界处组织，然后将其置于0.1%升汞中消毒30 s，并在无菌水中漂洗3次，再置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养皿中，在恒温培养箱中28 ℃下自然生长4 d。筛选出优势菌，将优势菌纯化后放入28 ℃恒温培养箱中培养，备用。
　　1.3  致病性测定
　　将分离纯化后的菌株培养3 d后接种到相同的健康降香黄檀离体叶片上，在28 ℃培养箱中保湿培养3 d后，培养观察。
　　1.4  分离菌株的鉴定
　　1.4.1  病原菌的形态学鉴定  将菌株JXHT16置于28 ℃的恒温培养箱中培养一段时间，待其产孢后，用显微镜观察病原菌的菌落、菌丝、分生孢子梗及分生孢子的形态特点。
　　1.4.2  病原菌的分子鉴定  采用CTAB法提取病原菌DNA，并用紫外分光计检测所提取的DNA浓度，将其稀释至50 ng/μL备用[7]。扩增采用真菌通用引物ITS1（5-TCCGTAGGTGAA CCT G C GG- 3）、ITS4（5-TCCTCCGCTTA TTGAT AT GC-3）（上海生工公司合成）。PCR反应总体系（25 μL）：10倍缓冲液2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL，引物各1 μL，Taq酶（5 U/μL）0.25 μL，模板DNA 2.0 μL（对照组加ddH2O，其他条件同实验组），ddH2O 18.25 μL。PCR反应条件：95 ℃变性5 min;95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环;72 ℃延伸10 min[8]。
　　1.5  降香黄檀叶枯病病原菌生物学特性研究
　　1.5.1  培养基对病原菌菌丝生长的影响  将在28 ℃恒温无菌培养箱中培养5 d的病原菌菌株沿菌落边缘用打孔器取直径为6 mm的菌饼，分别接种到含有PDA、PSA、PMA、PLA、PFA、淀粉等不同碳源的平板培養皿上，每皿1片，每个处理重复3次，置于28 ℃的恒温培养箱中培养，用十字交叉法[9]每隔2 d分别测定菌落直径，8 d后绘制菌丝生长速度的曲线图，并进行方差分析与多重比较[10]。
　　1.5.2  温度对病原菌菌丝生长的影响  用打孔器取直径为6 mm的病原菌菌饼接种到PDA平板上，分别置于0、5、10、15、20、25、30、35 ℃的培养箱中培养，处理重复3次，培养及测量方法同1.5.1。
　　1.5.3  pH对病原菌菌丝生长的影响  用打孔器取直径为6 mm的病原菌菌饼，分别接种到pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的PDA培养基上，处理重复3次，培养及测量方法同1.5.1。
　　1.5.4  光照对病原菌菌丝生长的影响  用打孔器取直径为6 mm的病原菌菌饼接种到PDA平板上，分别置于全光照、半光照与黑暗条件下的28 ℃恒温培养箱中培养，处理重复3次，培养及测量方法同1.5.1。
　　2  结果与分析
　　2.1  病原菌的分离与鉴定
　　2.1.1  病原菌分离与形态学鉴定  降香黄檀叶枯病在田间主要危害叶部与枝条，从叶尖开始发病，然后逐渐扩展到枝条。发病初期，病斑为水渍状的小斑点，且呈“V”字形，由淡青色逐渐变为淡褐色，病斑慢慢向叶茎交界处扩大，叶部中间稍凹陷，并变为深褐色，逐渐散生黑色小点（图1A）。病原菌菌落生长初期内呈白色，浓厚，棉絮状，近圆形，具有整齐的外边缘。4～5 d后菌落开始变为淡绿色，具有隔菌丝与黑褐色分生孢子器（图1E）。分生孢子一般有2种类型：一种为α型，呈椭圆形至纺锤形，为无色单胞，有的孢子两端会有油球出现，大小为（3.0～5.2）μm×（2.2～2.8）μm（图1B）;另一种为β型，丝状无色单胞，一端略弯，大小为（17.5～35.0）μm×（1.3～1.8）μm。本研究中分生孢子均为α型，由于环境与样本采集等不稳定因素的影响，往往只能看到α型孢子[11]。
　　2.1.2  致病性测定  3 d后分离菌接种在健康降香黄檀叶片上产生症状（图2A），由淡褐色逐渐变为深褐色，与叶片初始感染叶枯病出现的症状基本一致，而空白对照并没有出现症状。再分离菌株培养3 d的菌丝形态与原分离菌株表现一致（图2B）。因此，可以确定分离的菌株即为降香黄檀叶的病原菌菌株。
　　2.1.3  病原菌的分子鉴定  （1）病原菌菌株ITS区扩增及其序列比对。病原菌菌株的rDNA ITS区（含5.8S区）PCR扩增电泳结果见图3，从图3中可以看出，ITS区条带约600 bp，PCR扩增的条带一致、清晰，无杂带。
　　将测序所得JXHT16菌株的ITS序列输入GenBank核酸序列数据库中进行BLAST搜索，得到一系列同源性比较高的同属不同种的ITS序列，其中与GenBank登录号为JQ614001的天门冬拟茎点霉菌的ITS区间同源性最高且大于99%（图4）。从图4可以看出，所测JXHT16菌株序列与JQ614001菌株序列相比，10号位点缺少一个碱基T，562号位点多了一个碱基A。
　　（2）菌株系统发育树的构建分析。根据系统树规律鉴定种的方法，符合Taylor等[12]概述的用PSR（phylo genetic species recognition）来作为鉴定进化种的标准。图5结果显示，JXHT16菌株与拟茎点霉属菌株聚为一簇，遗传关系最近。结合此病原菌的形态特征，确定降香黄檀叶枯病斑中分离出来的JX H T16菌株为拟茎点霉属菌，且与天门冬拟茎点霉菌（JQ614001）具有最近的亲缘关系。 　　2.2  降香黄檀叶枯病原菌生物学特性
　　2.2.1  不同的培养基对病原菌菌丝生长的影响  不同的培养基对病原菌菌丝体的生长有不同的影响（图6，表1），降香黄檀叶枯病原菌在PDA、PSA、PMA、PLA、PFA、淀粉培养基上均能生长，病原菌菌丝体在PFA培养基中生长最快，平均菌落直径为4.94 cm，其次是PSA培养基和PDA培养基，平均菌落直径分别为4.85 cm和4.11 cm。淀粉培养基中生长最慢，平均菌落直径仅为2.12 cm。从菌落的颜色和形态看，病原菌在各培养基上均存在差异，在PDA、PSA、PMA、PFA培养基上菌落更致密一些，在PLA、淀粉培养基上菌落较稀疏一些。
　　2.2.2  温度对病原菌菌丝生长的影响  不同温度对病原菌菌丝生长的影响是不同的（图7），病原菌菌丝可以在10～30 ℃生长，较适宜生长的温度在20～30 ℃之间，平均菌落直径为2.20～3.61 cm，最适宜的温度在25～30 ℃之间，平均菌落直径为3.62 cm。从图中可以看出，温度在0～5 ℃、35 ℃以上时病原菌菌丝几乎不能生长。
　　2.2.3  不同pH对病原菌菌丝生长的影响  不同pH对病原菌菌丝生长的影响状况（图8），病原菌菌丝在pH为5～10均可以生长，但存在显著性差异。在pH 6时，菌落生长最快，菌落直径可以达到3.95 cm，菌落生长也很密集，所以最适宜菌落生长的pH为6。
　　2.2.4  光照对病原菌菌丝生长的影响  不同光照条件下对病原菌菌丝生长的影响不同（图9），病原菌菌丝在全光照和半光照条件下的平均菌落直径分别为4.94 cm和4.55 cm，差异不明显。全光与全黑条件下菌落直径平均相差1.43 cm，而全光与半光照条件下的平均菌落直径差为0.39 cm，差异小于前者，研究结果表明在全光条件下菌丝生长表现更致密一些。
　　3  讨论
　　拟茎点霉属[Phomopsis （Sacc.） Bubak]是半知菌类、腔孢纲、球壳孢目中的一个重要真菌属，有性态是间座壳属（Diaporthe），其种类多、分布较广[13]，但其种间形态具有较大的相似性。1980年Sutton在The Coelomycetes中给出了拟茎点霉属的定界，其主要形态学特征为：具有一个暗色的真子座质的分生孢子器，产生2型分生孢子，甲（）型分生孢子无色、单胞、椭圆形、纺锤形或长椭圆形，常含有2个油球;乙（β）型分生孢子无色、单胞、线形，顶端常成钩状或卷曲。分生孢子梗无色，分枝;产孢细胞圆柱状，内壁芽生瓶体式[13]。长期以来拟茎点霉的专化性一直被认识到属，因而种级分类主要是以寄主植物属为基础，寄生在同属植物上形态相符的即为一种，寄生于不同属植物即使是形态相近也常被命名为不同的种，截至2005年，报道该属的寄主植物共有74科[14]。
　　本研究对降香黄檀叶枯病的病原菌进行了形态学与分子生物学的鉴定，病原菌经BLAST同源性比对，与天门冬拟茎点霉菌相似度达99%，经形态学和ITS区间分子生物学鉴定降香黄檀叶枯病的病原菌为天门冬拟茎点霉菌[Phomopsis asparagi （Sacc.） Bubak]。
　　2005年Elena[15]首次报道了芦笋上由天门冬拟茎点霉菌引起的病害，此病在保护地和露地均可为害，是影响芦笋产量的典型病害[16]。而在降香黄檀和其他檀木类植物上未发现该病害的相关报道，本研究也是首次在降香黄檀叶片上发现由该病菌引起的病害。
　　通过对该病原菌的生物学特性研究，本研究得出以下结论：对降香黄檀叶枯病菌生长最有利的培养基为PFA培养基，平均菌落直径为4.94 cm，PSA培养基、PDA培养基稍次之，平均菌落直径分别为4.85 cm和4.11 cm。病原菌在可溶性淀粉培养基中生长速度最慢，平均菌落直径仅为2.12 cm。该病原菌的最适生长温度是25～30 ℃;最适合菌落生长的pH为6.0;光照对其生长影响不明显。本研究结果与刘志恒等[16]、顾振芳等[17]研究结果一致。由于病原菌的复杂性，今后可以在降香黄檀叶枯病的流行规律以及降香黄檀叶枯病的无公害防治等方面开展研究，即可对降香黄檀林木的保护、降香黄檀林木病害的防治和综合治理提供更多的科学依据。
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